광제어 생물학적 활성 화합물의 시험관 내 및 생체 내 평가 - 암 광약리학을 위한 잠재적 약물 후보

동물 관리 및 실험 절차는 실험실 동물과 관련된 연구 프로젝트 수행에 대한 지역 및 국제 규정에 따라 수행되었습니다(“잔인함으로부터 동물 보호에 관한 우크라이나 법률”, 실험 및 기타 과학적 목적으로 사용되는 척추동물 보호를 위한 유럽 협약(유럽 협약, Strasburg, 1986), 과학적 목적으로 사용되는 동물 보호에 관한 지침 2010/63/EU). 이 연구는 Bienta 회사의 생명윤리 위원회의 승인을 받았습니다. C57BL/6NCrl 마우스(각각 체중이 약 20g인 성체 암컷)를 본 실험에 사용하였다. 특정 재료, 시약 및 장비는 재료 표에 나열되어 있습니다. 1. 2D 및 3D LLC 세포 배양물을 사용한 LMB002(“ring-closed” 및 “ring-open” 형태)에 대한IC50 평가 화합물의 완충액 및 원액의 제조참고: 표준 절차를 사용하여 버퍼를 준비합니다. 또는 상업적으로 이용 가능한 솔루션을 사용하십시오.증류수 1L에 Na2HPO414.2g, KH2PO4 2.4g, NaCl 80g, KCl 2g을 가하여 10x 인산완충식염수(PBS)를 준비한다. 오토클레이브는 10x PBS를 제조하고, 900mL의 증류수에 10x 용액 100mL를 첨가하여 이를 1x 용액으로 희석한다. 이어서, 용액을 4°C에서 보관한다. 증류수 1L에 DPBS 분말 4.78g을 첨가하여 Dulbecco’s PBS(DPBS)를 준비합니다. 모든 고체가 용해 될 때까지 용액을 저어주고 pH 측정기를 사용하여 pH를 확인한 다음 1M NaOH 또는 1M HCl (pH 7.3-7.4)을 첨가하여 조정합니다. 원하는 pH 수준에 도달한 후 멸균 캐비닛에서 0.22μm 진공 필터를 통해 배지를 여과합니다. 4 °C에서 보관하십시오. 증류수 1L에 HEPES 238.3g을 첨가하여 1M 4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산(HEPES) 완충용액을 준비한다. pH 7.5가 될 때까지 1M NaOH로 용액의 pH를 조정합니다. 멸균 캐비닛의 0.22μm 진공 필터를 통해 여과합니다. 4 °C에서 보관하십시오. 1x 용액을 희석하여 1x 트립신-EDTA(EDTA = 에틸렌디아민테트라아세트산) 용액을 준비합니다. 이렇게 하려면 50mL 멸균 튜브에 있는 45mL 1x PBS 용액에 10배 트립신-EDTA 5mL를 추가합니다. 4 °C에서 보관하십시오. 1L의 증류수에 DMEM 고포도당 분말 13.4g과Na2CO33.7g을 교반판에 자석 교반봉을 놓고 측정 실린더에 넣어 Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM) basic을 준비합니다. 모든 고체가 용해 될 때까지 용액을 저어주고 pH 측정기를 사용하여 pH를 확인한 다음 1M NaOH 또는 1M HCl (pH 7.3-7.4)을 첨가하여 조정합니다. 바람직한 pH에 도달한 후, 멸균 캐비닛에서 0.22 μm 진공 필터를 통해 배지를 여과하고 4°C에서 보관한다. DMEM 염기성 900mL에 소태아혈청(FBS) 100mL, 페니실린-스트렙토마이신 용액 10mL, L-글루타민 용액 10mL, 1M HEPES 완충액 10mL를 넣어 DMEM 완전배지를 준비한다. 4 °C에서 보관하십시오. 테스트 화합물에 대한 원액을 준비합니다.각 화합물에 대해 고리 폐쇄 포토폼에 있는 5.12mg(예: LMB002) 2개의 1.5mL 미세 원심분리기 튜브(하나는 투명하고 다른 하나는 검은색 불투명 벽)로 무게를 잰다. 2.28mg의 양성 대조군(예: 그라미시딘 S)을 매우 투명한 벽 튜브에 잰다. 각 샘플에 100μL의 순수 DMSO를 추가하고 30초 동안 소용돌이칩니다. 투명 벽 튜브의 원액(LMB002)을 660nm 레이저(광출력 밀도 0.6W/cm2)로 조사하여 “링 폐쇄”에서 “링 개방” 형태로 광이성질화하여 완전한 혼합을 보장합니다. 색상이 짙은 자주색에서 밝은 갈색으로 눈에 띄게 바뀔 때까지 계속하십시오. 알루미늄 호일을 사용하여 빛으로부터 보호하십시오. 2D 세포 배양 실험-세포 파종(1일차)10 mL의 DMEM 완전 배지를 LLC 세포 배양물과 함께 T-75 플라스크로부터 15 mL 멸균 튜브로 옮긴다. 진공 펌프로 남은 매체를 흡입합니다. 5mL의 1x DPBS로 세포 배양액을 세척하고 진공 펌프로 용액을 흡인합니다. 세포를 3 mL의 1x 트립신-EDTA 용액으로 덮고, 플라스크를 5%CO2 분위기 하에 37°C에서 2-3분 동안 인큐베이션한다. 1x 트립신-EDTA 용액이 들어 있는 세포 배양 플라스크에 DMEM 배지(이전에 멸균 튜브로 옮김) 6mL를 추가하고 현탁액을 여러 번 피펫팅하여 세포 배양 플라스크 벽에서 세포를 씻어냄으로써 트립신 작용을 중지합니다. 현탁액을 15mL 튜브로 옮기고 200× g 에서 4분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후 진공 펌프로 상층액을 흡인합니다. 튜브 바닥에 있는 세포 펠릿을 만지지 마십시오. 2mL의 새로운 DMEM 완전 배지를 추가하고 여러 번 피펫팅하여 세포를 재현탁합니다. 약 15 μL의 현탁액을 0.5 mL 튜브에 샘플링하고, 15 μL의 0.4% 트립판 블루를 첨가하고, 수득한 혼합물을 세포 계수 챔버로 옮겨 세포를 계수한다. 계수 후, 시점당 25mL의 세포 현탁액을 준비한다. 투명한 바닥과 검은색 불투명 벽이 있는 96웰 플레이트의 중앙 60웰에 있는 200μL의 DMEM에 5,000-10,000개(평균 8,000개) LLC 세포/웰을 시드합니다. 나머지 36개의 웰을 순수 DMEM으로 채웁니다. 플레이트를 37°C 및 5% CO2에서 하룻밤 동안 세포 배양 인큐베이터에 넣습니다. 바닥판의 고르지 않은 가열을 방지하기 위해 아래에 플라스틱 판 뚜껑을 사용하십시오. 2D 세포 배양 실험 – 화합물 첨가(2일째)세포가 70%-80% 밀도에 도달할 때까지 플레이트에서 광학 현미경으로 세포를 모니터링합니다. 멸균 캐비닛의 진공 펌프로 우물에서 매체를 흡인합니다. 예열된 신선한 DMEM 배지 100μL를 추가하고 플레이트를 세포 배양 인큐베이터에 넣습니다. 테스트 화합물의 연속 희석액과 폴리프로필렌 오토클레이브 투명 플레이트에서 양성 대조군을 준비합니다. 개별 시점 측정에 대해 다음과 같은 솔루션을 만듭니다.참고: DMSO의 스톡으로 시작하여 DMEM으로 희석하되 최종 최고 농도에서 DMSO의 1% v/v를 초과하지 마십시오.그라미시딘 S의 128 μM 용액을 수득하기 위해, 198.7 μL의 DMEM에 1.3 μL의 20 mM 저장 용액을 첨가한다. “개환” 형태의 LMB002의 256 μM 용액을 수득하기 위해, 198.7 μL의 DMEM에 1.3 μL의 40 mM 용액을 첨가한다. “고리-닫힌” 형태의 LMB002의 512 μM 용액을 얻기 위해, 197.4 μL의 DMEM에 2.6 μL의 40 mM 저장 용액을 첨가한다. 각 농도 지점의 4세트를 얻기 위해 3번의 추가 반복을 수행합니다. 각 시작 웰에서 100 μL를 흡인하고, 100 μL의 DMEM이 있는 웰로 옮기고, 완전히 혼합하여 이중 희석 시리즈를 준비합니다.알림: 광전환 가능한 화합물로 작업하려면 다시 광이성질화를 방지하기 위해 조명 조정이 필요합니다. 멸균 캐비닛의 조명을 끄는 것이 좋습니다. 미리 첨가된 DMEM 100μL와 함께 56개의 웰에서 매번 100μL의 준비된 용액을 옮겨 웰(5-150μM)에서 화합물의 최종 농도를 얻습니다. 4개의 웰에 매번 100μL의 DMEM을 추가하여 음성 대조군으로 사용합니다. 제어되지 않은 광 전환을 방지하기 위해 알루미늄 호일 또는 플라스틱 보호용 불투명 덮개로 플레이트를 덮으십시오. 선택한 배양 시간(10분, 60분, 24시간 또는 72시간) 동안 37°C(여분의 플라스틱 플레이트 뚜껑 아래 사용)의 세포 배양 배양기에 플레이트를 놓습니다. 2D 세포 배양 실험 – 염색 및 이미징(2-5일)상이한 기간 동안 화합물과 함께 배양한 후, 10분 및 60분 동안 화합물과 함께 인큐베이션한 플레이트에 웰 당 50μL의 염색 용액을 추가합니다. 플레이트를 37°C에서 20분 동안 인큐베이션합니다.참고: 8μL의 20mM Hoechst 33342 용액(최종 농도는 5μM), 32.5μL의 1mM 프로피듐 요오드화물(PI) 용액(최종 농도는 1μM) 및 650μL의 비멸균 FBS를 5,810μL의 비멸균 1x PBS에 추가하여 시점당 스톡 염색 용액을 준비합니다. 세포가 온도 충격을 받는 것을 방지하기 위해 37°C의 수조에서 FBS 및 PBS를 예열합니다. 20x 대물 렌즈를 사용하여 자동 형광 이미징을 수행합니다. 24일(3일) 및 72일(5일) 동안 화합물과 함께 인큐베이션된 플레이트에 대해 동일한 염색 및 이미징 절차(단계 1.4.1 -1.4.2)를 반복합니다.참고: 일반적인 2D 플레이트 맵은 그림 2에 나와 있습니다. 3D 세포 배양 실험 – 세포 파종(1일차)참고: 이 섹션의 단계는 2D 실험(세포 배양 준비, 테스트된 화합물로 배양 및 이미징)에 대해 설명된 단계와 동일합니다(1.1-1.4단계). 그러나 이 경우 셀은 검은색의 불투명한 벽이 있는 384웰 초저접착 U자형 바닥 플레이트에서 콤팩트한 성숙 스페로이드로 준비됩니다. 이 크기의 플레이트를 사용하면 한 번의 실험에서 두 화합물을 비교할 수 있습니다.LLC 세포 배양을 사용하여 2D 실험 프로토콜에서 1.2.1-1.2.9단계를 반복합니다. 세포를 계수한 후, 25mL의 세포 현탁액을 준비한다. 384웰의 저결합 U자형 바닥판에 있는 50μL의 DMEM에 있는 모든 웰에서 웰당 1,000개의 세포를 시딩합니다. 40 × g 에서 30 초 동안 원심 분리하고 플레이트 셰이커로 250 rpm에서 1 분 동안 흔들어 웰 벽에서 바닥까지 세포를 흔들어줍니다. 플레이트를 37°C 및 5%CO2 의 인큐베이터에 배치하여 플레이트 바닥이 48시간 동안 고르지 않게 가열되는 것을 방지하기 위해 여분의 플라스틱 플레이트 뚜껑 위에 놓습니다. 3D 세포 배양 실험 – 화합물 첨가(3일째)현미경으로 플레이트의 세포를 모니터링하여 콤팩트한 성숙 스페로이드가 형성되었는지 확인합니다. 폴리프로필렌 오토클레이브 투명 플레이트에서 연구된 화합물의 연속 희석을 준비합니다. 이 경우 추가 화합물을 포함하십시오. 개별 시점 측정에 대해 다음과 같은 솔루션을 만듭니다.그라미시딘 S의 175 μM 및 350 μM 용액을 얻기 위해, 198.2 μL의 DMEM에 1.8 μL의 20 mM 저장 용액을 추가하고, 그에 따라 196.4 μL의 DMEM에 3.6 μL의 스톡을 추가한다. LMB002의 175 μM 및 350 μM 용액을 얻기 위해, “링 개방”형태, 199 μL의 DMEM에 1 μL의 40 mM 저장 용액을 추가하고, 1.8 μL의 스톡을 198.2 μL의 DMEM에 첨가한다. LMB002의 350μΜ 및 1,750μM 용액을 얻으려면 “고리 폐쇄” 형태로, 198.2μL의 DMEM에 1.8μL의 40mM 원액을 추가하고 이에 따라 191.2μL의 DMEM에 8.8μL의 스톡을 추가합니다. 3번의 추가 반복을 수행하여 각 농도점의 4세트를 얻습니다. 각 시작 웰에서 20 μL를 빼내고 180 μL의 DMEM과 함께 웰로 옮기고 완전히 혼합하여 연속 희석액을 얻습니다.알림: 광전환 가능한 화합물로 작업하려면 다시 광이성질화를 방지하기 위해 조명 조정이 필요합니다. 멸균 캐비닛의 조명을 끄는 것이 좋습니다. 50 μL의 DMEM을 함유하는 128개의 웰에 매번 20 μL의 준비된 용액을 옮겨 웰에서 화합물의 최종 농도를 얻는다. 대조군 역할을 하기 위해 3개의 웰에 매번 20μL의 DMEM을 추가합니다. 광전환 또는 증발을 방지하기 위해 알루미늄 호일 또는 플라스틱 보호 덮개로 플레이트를 덮으십시오. 선택한 배양 시간 동안 플라스틱 플레이트 뚜껑의 세포 배양 인큐베이터에 플레이트를 놓습니다. 3D 세포 배양 실험 – 염색 및 이미징(3-6일)1 mM 칼세인 AM 용액 13 μL(최종 농도는 1 μM), 20 mM Hoechst 33342 용액 22 μL(최종 농도는 33 μM), 1 mM PI 용액 40 μL(최종 농도는 3 μM), 비멸균 FBS 300 μL를 비멸균 1x PBS 2,625 μL에 첨가하여 시점당 염색 용액을 준비한다. 세포가 온도 충격을 받는 것을 방지하기 위해 37°C의 수조에서 FBS 및 PBS를 예열합니다. 화합물과 함께 상이한 기간 동안 배양한 후, 10분 동안 화합물과 함께 인큐베이션한 웰에 웰 당 20 μL의 염색 용액을 첨가한다. 37°C에서 2시간 동안 배양합니다. 20x 대물 렌즈를 사용하여 형광 컨포칼 이미징을 수행합니다. 24시간(4일) 및 72시간(6일) 동안 화합물과 함께 배양된 웰에 대해 동일한 염색 및 이미징 절차를 반복합니다.참고: 이 실험에서 칼세인 AM은 다색 염색 용액의 세 번째 성분으로 사용됩니다. 2D 및 3D 실험에서 얻은 이미지는 기기의 자동 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 분석됩니다. Hoechst 및 프로피듐 요오드화물 염료와 함께 염색된 세포는 괴사적으로 죽은 것으로 간주되며, 농도의 함수로서의 분획은IC50 값을 계산하는 데 사용됩니다. 그림 2: 2D 배양 실험을 위한 일반적인 플레이트 맵의 예. 화합물 및 대조군에 대한 색상 코드가 표시됩니다. 시험된 화합물의 농도(웰 내부의 수)는 μM으로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 2. 조직 대리모의 광전환 효율 결정 그림 3과 같이 샘플 조사를 위한 광학 트레인을 조립합니다(레이저 광원의 광 케이블, 가변 초점 거리의 렌즈, 불투명 커버가 있는 주사기 및 평평한 절단 끝으로 구성됨).렌즈의 초점 거리와 조리개를 변경하여 사용된 주사기의 내경보다 1-1.5mm 더 큰 직경을 가진 평평한 광선을 얻을 수 있지만 가능한 한 조리개 내에 있습니다. 끝이 절단되고 내경이 12.4mm이고 불투명 플라스틱 덮개로 덮인 5mL 주사기를 사용하십시오. 200mW의 레이저 출력에서 광도계로 측정한 대로 광학 시스템 출력의 전력 밀도를 ~103mW/cm2 로 설정합니다.알림: 모든 후속 작업은 가능한 최소한의 작업장 조명이 있는 어두운 방에서 수행해야 합니다. PBS에 3mg/mL 농도의 LMB002(“고리 폐쇄” 형태) 원액을 1mL 준비합니다. 플라스틱 용기에 LMB002의 비활성 광형이 로딩된 모델 조직 샘플을 준비한다. 일반적인 실행에서 신선한 다진 돼지고기 5g을 LMB002 원액 277μL 및 PBS 260μL와 기계적으로 혼합하여 샘플의 최종 농도 50mg/kg에 도달하고 조직/PBS 비율이 ~9/1(v/v)입니다. 준비된 샘플로 주사기를 채우고 내부에 기포가 없는지 확인하고 노출(절단) 끝에서 평평한 표면을 형성합니다.알림: 주사기에 있는 샘플의 실린더는 축을 따라 ~40mm를 차지해야 합니다. 방사선 조사amp 그림 3 과 같이 광학 트레인에서 9분 44초 동안 ~60J/cm2 노출에 해당합니다. 노출 후 피스톤을 사용하여 주사기에서 밀어내고 메스로 절단하여 4mm 두께의 샘플 조각을 준비합니다. 슬라이스의 무게를 측정하여 별도의 시험관에 넣고 조사된 표면으로부터의 평균 거리(mm)로 표시합니다. 시험관에서 두 개의 대조군 샘플 (최적량, 0.5-0.7 g)을 준비한다 : 하나는 PBS (54 μL)의 10 % (부피)와 혼합 된 다진 고기이고, 다른 하나는 2.4 단계에서 얻은 모델 조직 샘플을 10 분 동안 500 mW 레이저 광으로 조사하여 모든 LMB002 “고리 폐쇄”분자가 “고리 개방”형태로 전환되도록한다. 아세토니트릴-물 혼합물(70%/30% v/v, 0.01% 트리플루오로아세트산(TFA) 보충, 1.4mL/g)을 각 슬라이스와 대조군 샘플에 추가합니다. 유리 막대를 사용하여 내용물을 완전히 혼합하십시오. 실온에서 최소 10분 동안 인큐베이션하고, 혼합물을 5220 x g에서 20분 동안 원심분리하거나, 20 x g 에서 30분 동안 2회 원심분리하여 불용성 물질을 제거하고 상청액을 수집한다. 상층액(~0.7mL)을 조심스럽게 수집하고 16,000 x g 에서 30분 동안 다시 원심분리합니다. 상층액(각각 ~0.5mL)을 수집하고 분석용 C18 컬럼, 3.46% B/min의 선형 A:B 그래디언트, 2.0mL/min 유속 및 100μL의 주입 부피를 사용하여 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP HPLC)로 분석합니다. UV 검출 크로마토그램을 570nm(“고리 닫힘” 형태 검출) 및 270nm(“고리 개방” 형태 검출)에서 기록합니다. 조사되지 않은(단계 2.4) 및 조사된 대조군(단계 2.8) 샘플을 사용하여 두 광형의 특이적 머무름 시간을 결정하고(용리액 A: 수성 0.1% TFA; 용리액 B: 90% 아세토니트릴-물, 0.1% TFA) 방법을 보정합니다. 알려진 농도의 LMB002 용액의 크로마토그램을 취하여 분석한 검량선을 사용하여 분석된 샘플에서 LMB002 광형의 실제 양을 결정합니다. 보정을 위해 원액(2.3단계)을 아세토니트릴-물 혼합물(0.01% TFA로 보충된 70%/30% v/v)로 희석하여 LMB002 “링 폐쇄” 용액을 준비하여 100μL(주입된 부피)당 0.36, 0.9 및 3.6μg; 용리액 기울기 및 유속은 단계 2.12와 동일합니다. 실험 (2.4-2.12 단계)을 세 번 반복하고 플롯 (백분율) 대 거리 (조사 된 조직 표면으로부터)에 각 광형의 정규화 된 백분율을 플로팅합니다. 통계(즉, 각 농도 지점에서의 표준 편차)를 계산합니다. 그림 3: 모델 조직에서 광변환의 효율을 결정하기 위한 실험 설정. (a) 개략도 및 (b) 사진; 1, 레이저 광원의 광 케이블; 2, 가변 초점 거리의 렌즈; 및 3, 고기 다진 고기-LMB002-포스페이트-완충 식염수 혼합물 4에 넣고, 불투명 커버 및 절단된 프론트엔드를 갖는 주사기(커버 없이 (B)에 나타냄). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 3. 생체 내 항암 효능 결정 참고: 실험 일정과 끝점은 그림 4에 나와 있습니다. 후처리 기간의 동물 관리 기준은 적절한 케이지 밀도와 자원 가용성을 포함해야 하는 3R 규칙을 준수해야 합니다. 가능하면 터널이나 부항과 같은 혐오적이지 않은 동물 취급 방법을 준수하십시오. 도 4: 생체 내 치료 실험 일정. 실험 그룹의 지정, 치료 세부 사항, 종점 및 사후 분석 일정. 약어: LLC = 루이스 폐암; IV = 정맥 주사; SC = 피하. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 피하접종을 위한 암세포의 제조(0일).LLC 세포를 37°C 및 5%CO2에서 10% FBS, 100 U/mL 페니실린, 및 100 μg/mL 스트렙토마이신과 함께 DMEM(4.5 g/L 글루코스)으로 계대배양하였다. 0.05% 트립신-EDTA 용액을 사용하여 세포를 수확하고, 원심분리하고, 무혈청 DMEM에 현탁시킨다. 세포를 계수하고 혈구계 및 트리판 블루 배제 테스트를 사용하여 생존력을 결정합니다. DMEM과 Matrigel 혼합물(1:1)에서 농도 10 ×10 6 cells/mL의 최종 세포 현탁액을 준비합니다. 주사하기 전에 현탁액을 얼음 위에 보관하십시오. LLC 세포 접종(0일)성인 여성 C57BL/6NCrl 마우스(무게 ~20g)를 이소플루란 마취기의 유도 챔버에 넣습니다. 이소 플루 란의 5 %에서 진정 작용을 수행하고 동물이 완전히 의식을 잃을 때까지 기다리십시오. 면도하여 세포 접종 부위에서 모피를 제거하십시오. ~100μL의 DMEM: Matrigel(1:1) 혼합물에 5 ×10 5 LLC 세포를 오른쪽 뒷다리에 접종합니다.알림: 가능하면 단일 바늘 사용 방법을 준수하십시오. 화합물 투여 및 광조사참고: 접종 후 5-8일 이내에 동물은 종양이 만져지고 ~50-100mm3 부피에 도달하면 치료 준비가 됩니다. LMB002 및 세미 다크 조건 (작업장에서 최소 5m 떨어진 4W LED 램프 1 개)에서이 화합물로 처리 된 마우스로 모든 후속 작업을 수행하십시오.LMB002(“고리 폐쇄” 형태)를 5mg/kg(IV) 용량의 1mg/mL 농도로 멸균 생리 식염수에 용해시켜 진한 파란색 균질 용액을 얻습니다. 방사선 조사 전에 8 마리의 동물로 구성된 4 개의 그룹을 무작위로 조립하고 면도하여 종양 및 인근 부위에서 모피를 제거합니다. IV 주사를 위해 마우스를 홀더에 넣고 꼬리 정맥이 보이도록 37°C의 수조에서 동물의 꼬리를 예열합니다.참고: 수술 전 진통제를 고려하십시오. 꼬리 정맥에 5mL/kg의 화합물을 주입합니다. 두 대조군의 경우 동물당 100μL의 식염수(정맥 주사)(체중 20g)를 주사합니다. 두 실험 그룹의 동물이 비활성 광형(식염수 중 1mg/mL)으로 테스트된 화합물을 받도록 합니다.알림: 가능하면 단일 바늘 사용 방법을 준수하십시오. 그런 다음 화합물을 주입 한 후 2 시간 45 분 후에 마우스를 마취하에 놓습니다. 산소에서 3%-4% 이소플루란으로 진정을 유도합니다. 산소에 있는 0.5%-1% isoflurane를 가진 15 분 동안 마취를 유지하십시오. 종양 부위 만 빛에 노출시키는 구멍이있는 검은 색 마스크로 마우스를 덮으십시오. 650nm 레이저로 레이저 다이오드 모듈을 켜고 적색 레이저의 출력을 200mW로, 청색/UV 가이드 레이저의 출력을 2mW로 설정합니다.알림: 레이저 장치가 켜져 있을 때 파란색 보호 안경을 사용하십시오. 광도계로 적색 레이저(생쥐에서 떨어짐)의 광속을 측정하고 광속이 100mW/cm2인 광케이블과의 거리를 결정합니다. 광원이 종양에서 결정된 거리에 있고 빛이 전체 종양 영역을 덮도록 스탠드에 케이블을 고정합니다. 이 절차 중에 청색/UV 가이드 레이저 광을 사용하십시오. 적색 레이저를 켜서 종양 부위를 20분 동안 조사합니다. 조사 후, 이소 플루 란 흐름을 끄고 동물을 새장으로 되돌려 놓고 다음 30 분 동안 상태를주의 깊게 관찰하십시오.참고: 복합 투여 후 마우스를 2일 동안 어둠 속에 보관하십시오. 빛의 낮 주기만 변경되어야 합니다. 다른 모든 주거 조건은 변경되지 않아야 합니다. 후처리 관찰매일 동물을 관찰하고 종양의 무게와 크기를 측정하십시오. 종양 부피를 측정하고 괴사의 진행을 기록하십시오.참고: 후처리 기간의 동물 관리 기준은 적절한 케이지 밀도와 자원 가용성을 포함해야 하는 3R 규칙을 준수해야 합니다. 이전 단계에서 수집한 데이터를 사용하여 사망률을 평가합니다. 표준 절차를 사용하여 생존율을 결정하십시오.참고: 심각한 임상 징후(체중 15% 이상 감소, 종양 궤양이 7일 이내에 치유되지 않음, 발성)가 나타나거나 종양 부피가 2,500mm3에 도달하자마자 동물을 희생하고 죽은 것으로 간주해야 합니다.