光制御された生物学的に活性な化合物のin vitroおよびin vivo評価-癌光薬理学の潜在的な薬剤候補

動物の世話と実験手順は、実験動物を含む研究プロジェクトの実施に関する国内および国際的な規制に従って実施されました(ウクライナの法律「残虐行為からの動物の保護について」、実験およびその他の科学的目的で使用される脊椎動物の保護に関する欧州条約(欧州条約、ストラスバーグ、1986年)、科学的目的で使用される動物の保護に関する指令2010/63 / EU)。この研究は、Bienta社の生命倫理委員会によって承認されています。これらの実験では、C57BL/6NCrlマウス(各体重約20 gの成体雌)を使用しました。特定の材料、試薬、および機器は、 材料の表に記載されています。 1. 2Dおよび3D LLC細胞培養を使用したLMB002(「リングクローズ」および「リングオープン」フォーム)のIC50 評価 化合物の緩衝液およびストック溶液の調製メモ: 標準的な手順を使用してバッファーを準備します。あるいは、市販の溶液を使用してください。14.2 gのNa2HPO 4、2.4 gのKH 2 PO4、80 gのNaCl、および2gのKClを蒸留水1 Lに加えて、10倍のリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を調製します。オートクレーブは10x PBSを調製し、100 mLの10x溶液を900 mLの蒸留水に加えて1x溶液に希釈します。その後、溶液を4°Cで保存する。 4.78 gのDPBS粉末を1 Lの蒸留水に加えて、ダルベッコのPBS(DPBS)を調製します。すべての固体が溶解するまで溶液を攪拌し、pHメーターを使用してpHを確認し、1 M NaOHまたは1 M HCl(pH 7.3〜7.4)を加えて調整します。望ましいpHレベルに達したら、滅菌キャビネット内の0.22 μm真空フィルターで培地をろ過します。4°Cで保存してください。 238.3 gのHEPESを蒸留水1 Lに加えて、1 M 4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES)緩衝液を調製します。溶液のpHを1 M NaOHでpH 7.5になるまで調整します。滅菌キャビネット内の0.22 μm真空フィルターでろ過します。4°Cで保存してください。 10倍溶液を希釈して1xトリプシン-EDTA(EDTA=エチレンジアミン四酢酸)溶液を調製する。これを行うには、50 mL滅菌チューブ内の45 mL 1x PBS溶液に5 mLの10 x トリプシン-EDTAを追加します。4°Cで保存してください。 攪拌プレート上に置かれた磁気攪拌棒を有する測定シリンダーに13.4gのDMEM高グルコース粉末および3.7gのNa2CO3を1Lの蒸留水に添加することによって、ダルベッコの改変イーグル培地(DMEM)塩基性を調製する。すべての固体が溶解するまで溶液を攪拌し、pHメーターを使用してpHを確認し、1 M NaOHまたは1 M HCl(pH 7.3〜7.4)を加えて調整します。望ましいpHに達したら、滅菌キャビネット内の0.22 μm真空フィルターで培地をろ過し、4°Cで保管します。 900 mLのDMEM塩基性に100 mLのウシ胎児血清(FBS)、10 mLのペニシリン-ストレプトマイシン溶液、10 mLのL-グルタミン溶液、および10 mLの1 M HEPESバッファーを加えて、DMEM完全培地を調製します。4°Cで保存してください。 試験化合物の原液を調製します。各化合物について、リングクローズドフォトフォームで5.12 mgの2つのバッチ(LMB002など)を2つの1.5 mLマイクロ遠心チューブ(1つは透明で、もう1つは黒色の不透明壁)に計量します。2.28 mgのポジティブコントロール(例:.、グラミシジンS)を非常に透明な壁のチューブに入れます。.各サンプルに100 μLの純粋なDMSOを加え、30秒間ボルテックスします。 透明壁管内の原液(LMB002)に660nmレーザー(光パワー密度0.6W/cm2)をボルテックスで照射し、完全混合することにより、「閉環」から「開環」形態に光異性化する。色が濃い紫色から明るい茶色に目に見えて変わるまで続けます。アルミホイルを使用して光から保護します。 2D細胞培養実験-細胞の播種(1日目)10 mLのDMEM完全培地をLLC細胞培養液とともにT-75フラスコから15 mL滅菌チューブに移します。残った培地を真空ポンプで吸引します。 細胞培養物を5 mLの1x DPBSで洗浄し、溶液を真空ポンプで吸引します。 細胞を3 mLの1xトリプシン-EDTA溶液で覆い、フラスコを5%CO2 雰囲気中で37°Cで2〜3分間インキュベートします。 1xトリプシン-EDTA溶液を含む細胞培養フラスコに6 mLのDMEM培地(滅菌チューブに予め移した)を添加してトリプシン作用を停止し、懸濁液を数回ピペッティングして細胞培養フラスコ壁から細胞を洗い流します。 懸濁液を15 mLチューブに移し、200 × g で4分間遠心分離します。遠心分離後、上清を真空ポンプで吸引する。チューブの底にあるセルペレットに触れないでください。 2 mLの新鮮なDMEM完全培地を添加し、数回ピペッティングして細胞を再懸濁します。 約15 μLの懸濁液を0.5 mLチューブにサンプリングし、15 μLの0.4%トリパンブルーを添加し、得られた混合物をセルカウントチャンバーに移して細胞をカウントします。 計数後、時点あたり25 mLの細胞懸濁液を調製します。5,000-10,000(平均8,000)LLC細胞/ウェルを200μLのDMEMに、透明な底部と黒色の不透明な壁を有する96ウェルプレートの中央60ウェルに播種する。残りの36ウェルを純粋なDMEMで満たします。 プレートを細胞培養インキュベーターに37°C、5%CO2で一晩置きます。 底板の不均一な加熱を防ぐために、下にプラスチックプレートの蓋を使用します。 2D細胞培養実験-化合物添加(2日目)細胞が70%〜80%のコンフルエントに達するまで、プレート内の光学顕微鏡によって細胞をモニターします。 滅菌キャビネット内の真空ポンプでウェルから培地を吸引します。100 μLの新鮮な予熱済みDMEM培地を加え、プレートを細胞培養インキュベーターに入れます。 ポリプロピレンオートクレーブ滅菌透明プレートで試験化合物とポジティブコントロールの段階希釈液を調製します。個々の時点測定に対して次のソリューションを作成します。注意: DMSOのストックから始めてDMEMで希釈しますが、最終的な最高濃度でDMSOの1%v / vを超えないようにしてください。グラミシジンSの128 μM溶液を得るには、1.3 μLの20 mMストック溶液を198.7 μLのDMEMに加えます。 「リングオープン」形態のLMB002の256 μM溶液を得るには、1.3 μLの40 mM溶液を198.7 μLのDMEMに加えます。 「リングクローズ」形態のLMB002の512 μM溶液を得るには、2.6 μLの40 mMストック溶液を197.4 μLのDMEMに加えます。 さらに3回繰り返して、各濃度ポイントを4セット取得します。各開始ウェルから100 μLを吸引し、100 μLのDMEMを含むウェルに移し、十分に混合することにより、二重希釈シリーズを調製します。注意: 光切り替え可能な化合物を使用する場合は、逆光異性化を防ぐために照明を調整する必要があります。滅菌キャビネットの照明をオフにすることをお勧めします。 100 μLの予め添加されたDMEMと共に56ウェルに毎回100 μLの調製溶液を移すことによって、ウェル(5-150 μM)中の化合物の最終濃度を得る。4つのウェルに毎回100 μLのDMEMを添加し、ネガティブコントロールとして使用します。 制御されていない光スイッチングを防ぐために、アルミホイルまたはプラスチック保護の不透明なカバーでプレートを覆います。プレートを37°Cの細胞培養インキュベーターに入れ(予備のプラスチックプレートの蓋の下に使用)、選択したインキュベーション時間(10分、60分、24時間、または72時間)します。 2D細胞培養実験 – 染色とイメージング(2〜5日目)化合物と異なる期間インキュベートした後、化合物とともに10分および60分間インキュベートしたプレートに、ウェルあたり50 μLの染色溶液を加えます。プレートを37°Cで20分間インキュベートします。注:8 μLの20 mM Hoechst 33342溶液(最終濃度は5 μM)、32.5 μLの1 mMヨウ化プロピジウム(PI)溶液(最終濃度は1 μM)、および650 μLの非滅菌FBSを5,810 μLの非滅菌1x PBSに加えて、時点ごとにストック染色溶液を調製します。FBSとPBSを37°Cの水浴で予熱し、細胞が温度ショックを受けないようにします。 20倍の対物レンズを使用して自動蛍光イメージングを実行します。 化合物とともに24時間(3日目)および72時間(5日目)インキュベートしたプレートについて、同じ染色およびイメージング手順(ステップ1.4.1〜1.4.2)を繰り返します。注:典型的な2Dプレートマップを 図2に示します。 3D細胞培養実験 – 細胞の播種(1日目)注:このセクションの手順は、細胞培養の2D実験準備、テスト済み化合物とのインキュベーション、およびイメージング(ステップ1.1〜1.4)で説明した手順と同じです。ただし、この場合、細胞は、黒色の不透明な壁を持つ384ウェルの超低接着U底プレートでコンパクトな成熟スフェロイドとして調製されます。このサイズのプレートを使用すると、1回の実験で2つの化合物を比較することができます。LLC細胞培養を用いて、2D実験プロトコルのステップ1.2.1-1.2.9を繰り返します。 細胞を計数した後、25mLの細胞懸濁液を調製する。384ウェルの低結合U底プレートに50 μLのDMEM中のすべてのウェルに1,000細胞を播種します。 40 × g で30秒間遠心分離し、プレートシェーカーで250 rpmで1分間振とうして、細胞をウェルの壁から底まで振り落とします。 プレート底部が48時間不均一に加熱されないように、プレートを37°C、5%CO2 のインキュベーターに余分なプラスチックプレート蓋の上に置きます。 3D細胞培養実験-化合物添加(3日目)プレート内の細胞を顕微鏡でモニタリングし、コンパクトな成熟スフェロイドが形成されていることを確認します。 ポリプロピレンオートクレーブ滅菌透明プレートで研究化合物の段階希釈液を調製します。この場合、追加の化合物を含めます。個々の時点測定に対して次のソリューションを作成します。グラミシジンSの175 μMおよび350 μM溶液を得るには、1.8 μLの20 mMストック溶液を198.2 μLのDMEMに、3.6 μLのストックを196.4 μLのDMEMにそれぞれ加えます。 「リングオープン」形態のLMB002の175 μMおよび350 μM溶液を得るには、1 μLの40 mMストック溶液を199 μLのDMEMに、1.8 μLのストックを198.2 μLのDMEMにそれぞれ加えます。 「リングクローズ」形態のLMB002の350 μ および 1,750 μM 溶液を得るには、1.8 μL の 40 mM ストック溶液を 198.2 μL の DMEM に、8.8 μL のストックを 191.2 μL の DMEM にそれぞれ加えます。 さらに3回の反復を実行して、各濃度点を4セット取得します。各開始ウェルから20 μLを引き出し、ウェルに移し、180 μLのDMEMで十分に混合することにより、段階希釈液を取得します。注意: 光切り替え可能な化合物を使用する場合は、逆光異性化を防ぐために照明を調整する必要があります。滅菌キャビネットの照明をオフにすることをお勧めします。 50 μLのDMEMを含む128個のウェルに毎回20 μLの調製溶液を移すことにより、ウェル内の化合物の最終濃度を取得します。コントロールとして機能するために、3つのウェルに毎回20 μLのDMEMを追加します。プレートをアルミホイルまたはプラスチックの保護カバーで覆い、光の切り替えや蒸発を防ぎます。 選択したインキュベーション時間、プラスチックプレートの蓋上の細胞培養インキュベーターにプレートを置きます。 3D細胞培養実験-染色とイメージング(3〜6日目)13 μLの1 mMカルセインAM溶液(最終濃度は1 μM)、22 μLの20 mM Hoechst 33342溶液(最終濃度は33 μM)、40 μLの1 mM PI溶液(最終濃度は3 μM)、300 μLの非滅菌FBSを2,625 μLの非滅菌1x PBSに加えて、時点ごとに染色溶液を調製します。FBSとPBSを37°Cの水浴で予熱し、細胞が温度ショックを受けないようにします。 化合物と異なる期間インキュベートした後、化合物とともに10分間インキュベートしたウェルにウェルあたり20 μLの染色溶液を加えます。37°Cで2時間インキュベートします。 20倍の対物レンズを使用して蛍光共焦点イメージングを実行します。 化合物とともに24時間(4日目)および72日目(6日目)インキュベートしたウェルについて、同じ染色およびイメージング手順を繰り返します。注:この実験では、カルセインAMを多色染色溶液の第3成分として使用します。2Dおよび3D実験から得られた画像は、機器の自動画像解析ソフトウェアを使用して分析されます。Hoechst色素およびヨウ化プロピジウム色素と共染色された細胞は壊死していると見なされ、濃度の関数としてのそれらの画分を使用してIC50 値を計算します。 図2:2D培養実験の代表的なプレートマップの例。 コンパウンドとコントロールのカラーコードが示されています。試験された化合物の濃度(ウェル内の数値)はμMで示されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 2.組織サロゲートにおける光スイッチング効率の決定 図3に示すように、サンプル照射用の光列(レーザー光源からの光ケーブル、焦点距離可変レンズ、不透明カバー付きシリンジ、およびフラットカットエンドで構成)を組み立てます。レンズの焦点距離と絞りを変えることにより、使用済みシリンジの内径より1〜1.5 mm大きいが、可能な限り絞り内にある直径の平らな光線を得る。 切断端が内径12.4 mmで、不透明なプラスチックカバーで覆われた5 mLシリンジを使用します。レーザー出力が200mWの場合、光度計で測定した光学系の出力のパワー密度を~103mW/cm2 に設定します。注意: その後のすべての操作は、職場の照明を最小限に抑えた暗い部屋で実行する必要があります。 3 mL の LMB002 (「閉環」形態) ストック溶液を 1 mg/mL の濃度で PBS で調製します。 LMB002の不活性フォトフォームをプラスチック容器にロードしたモデル組織サンプルを準備します。典型的な分析では、5 gの新鮮な豚ひき肉を277 μLのLMB002ストック溶液および260 μLのPBSと機械的に混合して、サンプル中の最終濃度50 mg/kgに達し、組織/PBS比は~9/1(v/v)になります。 シリンジに準備したサンプルを満たし、気泡が内部にないことを確認し、露出(切断)端に平らな面を形成します。注:シリンジ内のサンプルのシリンダーは、軸に沿って~40mmを占める必要があります。 図3に示すように、光列内のサンプルを9分44秒間、~60 J/cm2の露光に相当します。 露出後、ピストンを使用してシリンジから押し出し、メスで切断することにより、サンプルの厚さ4 mmのスライスを準備します。スライスを計量して別々の試験管に入れ、照射面からの平均距離(mm)でマークします。 試験管に2つの対照サンプル(最適量、0.5〜0.7 g)を準備します:一方のミンチ肉に10%(容量)のPBS(54 μL)を混合し、もう一方では、ステップ2.4で得られたモデル組織サンプルに500 mWのレーザー光を10分間照射して、すべてのLMB002「閉環」分子が「開環」型に変換されるようにします。 アセトニトリルと水の混合物(70%/30% v/v、0.01%トリフルオロ酢酸(TFA)、1.4 mL/gを添加)を各スライスとコントロールサンプルに加えます。ガラス棒を使用して内容物を完全に混合します。 室温で少なくとも10分間インキュベートし、混合物を5220 x gで20分間遠心分離するか、20 x gで30分間遠心分離して2回不溶性物質を除去し、上清を収集します。 上清(~0.7 mL)を注意深く回収し、16,000 x g で30分間遠心分離します。 上清(各~0.5 mL)を回収し、分析用C18カラム、3.46% B/minの線形A:Bグラジエント、2.0 mL/minの流速、および100 μLの注入量を備えた逆相高速液体クロマトグラフィー(RP HPLC)で分析します。570 nm(「閉環」型の検出)および270 nm(「開環」型の検出)でUV検出クロマトグラムを記録します。非照射(ステップ2.4)および照射コントロール(ステップ2.8)サンプルを使用して、両方のフォトフォーム(溶離液A:0.1%TFA水溶液;溶離液B:90%アセトニトリル水、0,1%TFA)の特定の保持時間を決定し、メソッドを校正します。 既知の濃度のLMB002溶液のクロマトグラムを取得および分析して得られた検量線を使用して、分析サンプル中のLMB002フォトフォームの実際の量を決定します。キャリブレーションのために、ストック溶液(ステップ2.3)をアセトニトリルと水の混合物(0.01%TFAを添加した70%/30%v/v)で希釈してLMB002「リングクローズド」溶液を調製し、100 μL(注入量)あたり0.36、0.9、および3.6 μgを取得します。溶離液の勾配と流速はステップ2.12と同じです。 実験(ステップ2.4-2.12)を3回繰り返し、各フォトフォームの正規化されたパーセントをプロット(パーセンテージ)対距離(照射された組織表面から)にプロットします。統計量(つまり、各濃度点での標準偏差)を計算します。 図3:モデル組織における光変換の効率を決定するための実験セットアップ。 (A)模式図および(B)写真; 1、レーザー光源からの光ケーブル。 2、可変焦点距離のレンズ。 図3、 肉ミンチ-LMB002-リン酸緩衝生理食塩水混合物4に入れ、不透明カバー付きのシリンジを、前端を切断した(カバーなしの(B)に示す)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 3. 生体内 抗がん効果測定 注:実験スケジュールとエンドポイントを 図4に示します。治療後の動物の飼育基準は、3R規則に準拠する必要があります-ハウジングには、適切なケージ密度とリソースの可用性を含める必要があります。可能な限り、トンネルやカッピングなどの嫌悪感のない動物の取り扱い方法を順守してください。 図4: in vivo 治療実験のスケジュール。 実験群の指定、治療の詳細、エンドポイント、および 死後 分析スケジュール。略語:LLC =ルイス肺癌;IV =静脈内;SC =皮下。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 皮下接種のための癌細胞の調製(0日目)。LLC細胞をDMEM(4.5 g / Lグルコース)中で、10S、100 U / mLペニシリン、および100 μg / mLストレプトマイシンで37°Cおよび5%CO2で継代します。 0.05%トリプシン-EDTA溶液を使用して細胞を回収し、遠心分離し、無血清DMEMに懸濁します。 細胞を数え、血球計算盤とトリパンブルー排除試験を使用してそれらの生存率を決定します。 DMEMとマトリゲルミックス(1:1)で濃度10 ×10 6 細胞/ mLの最終細胞懸濁液を調製します。注射前に懸濁液を氷上に保管してください。 LLC細胞接種(0日目)成体メスのC57BL/6NCrlマウス(体重~20g)をイソフルラン麻酔器の誘導室に入れます。イソフルランの5%で鎮静を行い、動物が完全に意識を失うまで待ちます。 剃毛によって細胞接種の領域から毛皮を取り除きます。 5 ×10 5 LLC細胞を~100 μLのDMEM:マトリゲル(1:1)混合物で右後肢に接種します。注意: 可能な限り、単針の使用方法を順守してください。 化合物投与と光照射注:接種後5〜8日で、腫瘍が触知可能になり、~50〜100 mm3 の体積に達したとき、動物は治療の準備ができています。LMB002およびこの化合物で処理したマウスを半暗条件下(職場から少なくとも5 mの4 W LEDランプ1個)でその後のすべての操作を実行します。LMB002(「閉環」形態)を滅菌生理食塩水に1 mg/mLの濃度で5 mg/kg(IV)の用量で溶解して、濃い青色の均一な溶液を得ます。 照射前に、8匹ずつの4群を無作為に組み立て、剃毛により腫瘍とその周辺から毛並みを取り除きます。 マウスをIV注射用のホルダーに入れ、37°Cの水浴で動物の尾を予熱して尾静脈を見えるようにします。注:術前鎮痛を検討してください。 化合物を5 mL / kgで尾静脈に注入します。2つの対照群について、動物あたり100μLの生理食塩水を(静脈内)注射する(体重20g)。2つの実験グループの動物が、不活性な光体(生理食塩水中で1 mg / mL)でテストされた化合物を受け取っていることを確認します。注意: 可能な限り、単針の使用方法を順守してください。 次いで、化合物の注射から2時間45分後、マウスを麻酔下に置く。酸素中の3%〜4%イソフルランで鎮静を誘発する。酸素中の0.5%-1%イソフルランで15分間麻酔を維持します。 腫瘍領域のみを光にさらす穴のある黒いマスクでマウスを覆います。 650 nmレーザーでレーザーダイオードモジュールの電源を入れ、赤色レーザーの出力を200 mWに、青色/UVガイドレーザーの出力を2 mWに設定します。注意: レーザーデバイスの電源が入っているときは、青い保護メガネを使用してください。 赤色レーザーからの光束(マウスから離れている)を光度計で測定し、光束が100 mW/cm2である光ケーブルからの距離を決定します。ケーブルをスタンドに固定して、光源が腫瘍から決定された距離にあり、光が腫瘍領域全体をカバーすることを確認します。この手順では、青色/ UVガイドレーザー光を使用してください。 赤色レーザーをオンにして、腫瘍領域に20分間照射します。 照射後、イソフルランの流れを止め、動物をケージに戻し、次の30分間にわたってその状態を注意深く観察します。注:化合物投与後、マウスを2日間暗所に保ちます。光日のサイクルのみを変更する必要があります。他のすべての住宅条件は変更されないままであるべきです。 治療後の観察動物を毎日観察し、腫瘍の重量と寸法を測定します。腫瘍の体積を測定し、壊死の進行に注意してください。注:治療後の動物の飼育基準は、3R規則に準拠する必要があります-ハウジングには、適切なケージ密度とリソースの可用性を含める必要があります。 前の手順で収集したデータを使用して、死亡率を評価します。標準的な手順を使用して生存率を決定します。注:重度の臨床徴候(体重減少が15%を超える、腫瘍潰瘍が7日間で治癒しない、発声)が明らかになった場合、または腫瘍の体積が2,500 mm3に達したらすぐに、動物を犠牲にして死亡としてカウントする必要があります。