In vitro en in vivo evaluatie van fotogecontroleerde biologisch actieve verbindingen - potentiële kandidaat-geneesmiddelen voor fotofarmacologie van kanker

Dierverzorging en experimentele procedures werden uitgevoerd volgens de lokale en internationale regelgeving voor het uitvoeren van onderzoeksprojecten met proefdieren (de wet van Oekraïne “Over de bescherming van dieren tegen wreedheid”, Europees Verdrag voor de bescherming van gewervelde dieren die worden gebruikt voor experimentele en andere wetenschappelijke doeleinden (Europees verdrag, Strasburg, 1986), Richtlijn 2010/63 / EU inzake de bescherming van dieren die voor wetenschappelijke doeleinden worden gebruikt). Deze studie is goedgekeurd door de Bioethics Commission van Bienta company. C57BL/6NCrl muizen (volwassen vrouwtjes met een gewicht van ongeveer 20 g per stuk) werden gebruikt in deze experimenten. Specifieke materialen, reagentia en apparatuur worden vermeld in de materiaaltabel. 1. IC50-evaluatie voor LMB002 (“ring-gesloten” en “ring-open” vormen) met behulp van 2D- en 3D LLC-celculturen Bereiding van buffers en stamoplossingen van de verbindingenOPMERKING: Bereid buffers voor met behulp van standaardprocedures. U kunt ook commercieel beschikbare oplossingen gebruiken.Bereid 10x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) door 14,2 g Na 2 HPO 4, 2,4 g KH 2 PO4, 80 g NaCl en2g KCl toe te voegen aan 1 L gedestilleerd water. Autoclaaf bereid 10x PBS en verdun het tot 1x oplossing door 100 ml 10x oplossing toe te voegen aan 900 ml gedestilleerd water. Bewaar de oplossing vervolgens bij 4 °C. Bereid Dulbecco’s PBS (DPBS) door 4,78 g DPBS-poeder toe te voegen aan 1 L gedestilleerd water. Roer de oplossing totdat alle vaste stof is opgelost, controleer de pH met een pH-meter en pas deze aan door 1 M NaOH of 1 M HCl (pH 7,3-7,4) toe te voegen. Nadat u de gewenste pH-waarde hebt bereikt, filtert u het medium door een vacuümfilter van 0,22 μm in een steriele kast. Bewaren bij 4 °C. Bereid 1 M 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonzuur (HEPES) bufferoplossing door 238,3 g HEPES toe te voegen aan 1 l gedestilleerd water. Pas de pH van de oplossing aan met 1 M NaOH tot pH 7,5. Filtreer door een vacuümfilter van 0,22 μm in een steriele kast. Bewaren bij 4 °C. Bereid 1x trypsine-EDTA (EDTA = ethyleendiaminetetra-azijnzuur) oplossing door 10x oplossing te verdunnen. Voeg hiervoor 5 ml 10x Trypsine-EDTA toe aan 45 ml 1x PBS-oplossing in een steriele buis van 50 ml. Bewaren bij 4 °C. Bereid Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) basic door 13,4 g DMEM-hoog glucosepoeder en 3,7 g Na2CO3 tot 1 L gedestilleerd water toe te voegen in een maatcilinder met een magnetische roerstaaf op een roerplaat. Roer de oplossing totdat alle vaste stof is opgelost, controleer de pH met een pH-meter en pas deze aan door 1 M NaOH of 1 M HCl (pH 7,3-7,4) toe te voegen. Na het bereiken van de gewenste pH filtert u het medium door een vacuümfilter van 0,22 μm in een steriele kast en bewaart u het bij 4 °C. Bereid DMEM compleet medium door 100 ml foetaal runderserum (FBS), 10 ml penicilline-streptomycine-oplossing, 10 ml L-glutamine-oplossing en 10 ml 1 M HEPES-buffer toe te voegen aan 900 ml DMEM basisch. Bewaren bij 4 °C. Bereid stamoplossingen voor de teststoffen.Weeg voor elke verbinding twee batches van 5,12 mg (bijv. LMB002) in de ringgesloten fotovorm in twee microcentrifugebuizen van 1,5 ml (één met heldere en andere zwarte niet-transparante wanden). Weeg 2,28 mg positieve controle (bijv. gramicidin S) af in een extra heldere wandbuis. Voeg 100 μL zuivere DMSO toe aan elk monster en vortex gedurende 30 s. Foto-isomeriseer de stamoplossing (LMB002) in de heldere wandbuis van de “ring-gesloten” naar de “ring-open” vorm door de oplossing te bestralen met 660 nm laser (lichtvermogensdichtheid 0,6 W / cm2) met vortexing om een grondige menging te garanderen. Ga door totdat de kleur zichtbaar verandert van donkerpaars naar lichtbruin. Bescherm tegen licht met aluminiumfolie. 2D celkweek experiment-seeding van de cellen (dag 1)Breng 10 ml van het DMEM complete medium over van de T-75 kolf met een LLC-celcultuur naar een steriele buis van 15 ml. Zuig het overgebleven medium op met een vacuümpomp. Was de celkweek met 5 ml 1x DPBS en zuig de oplossing op met een vacuümpomp. Bedek de cellen met 3 ml 1x trypsine-EDTA-oplossing en incubeer de kolf gedurende 2-3 minuten bij 37 °C in een CO 2-atmosfeer van 5%. Stop de trypsine-werking door 6 ml van het DMEM-medium (eerder overgebracht naar een steriele buis) toe te voegen aan de celkweekkolf met 1x trypsine-EDTA-oplossing en de suspensie meerdere keren te pipetteren om de cellen van de celkweekkolfwanden te wassen. Breng de suspensie over in een buis van 15 ml en centrifugeer gedurende 4 minuten op 200 × g . Na centrifugeren, zuig het supernatant op met een vacuümpomp. Raak de celkorrel aan de onderkant van de buis niet aan. Resuspendeer de cellen door 2 ml vers DMEM compleet medium toe te voegen en meerdere keren te pipetteren. Tel de cellen door ongeveer 15 μL van de suspensie in een buis van 0,5 ml te bemonsteren, 15 μL 0,4% trypanblauw toe te voegen en het verkregen mengsel in een celtelkamer over te brengen. Bereid na het tellen 25 ml van de celsuspensie per tijdstip voor. Zaai 5.000-10.000 (gemiddeld 8.000) LLC-cellen / put in 200 μL DMEM in de centrale 60 putten van een 96-putplaat met heldere bodem en zwarte niet-transparante wanden. Vul de overige 36 putten met pure DMEM. Plaats de platen een nacht in een celkweekincubator bij 37 °C en 5% CO2. Gebruik plastic plaatdeksels eronder om ongelijkmatige verwarming van de bodemplaat te voorkomen. 2D-celkweekexperiment – toevoegen van de verbindingen (dag 2)Controleer de cellen door lichtmicroscopie in de platen totdat de cellen 70% -80% confluentie hebben bereikt. Zuig het medium uit de putten met een vacuümpomp in een steriele kast. Voeg 100 μL van het verse voorverwarmde DMEM-medium toe en plaats de platen in een celkweekincubator. Bereid seriële verdunningen van de teststoffen en positieve controle in polypropyleen geautoclaveerde heldere platen. Maak de volgende oplossingen voor individuele tijdpuntmetingen:OPMERKING: Begin met de voorraden in DMSO en verdun met DMEM, maar niet meer dan 1% v/v DMSO in de uiteindelijk hoogste concentratie.Om een 128 μM-oplossing van gramicidin S te verkrijgen, voegt u 1,3 μL 20 mM stamoplossing toe aan 198,7 μL DMEM. Om een 256 μM-oplossing van LMB002, “ring-open” vorm te verkrijgen, voegt u 1,3 μL 40 mM-oplossing toe aan 198,7 μL DMEM. Om een 512 μM-oplossing van LMB002, “ring-gesloten” vorm te verkrijgen, voegt u 2,6 μL 40 mM stamoplossing toe aan 197,4 μL DMEM. Voer drie extra herhalingen uit om vier sets van elk concentratiepunt te verkrijgen. Bereid een dubbele verdunningsreeks voor door 100 μL uit elk startputje te zuigen, over te brengen naar een put met 100 μL DMEM en grondig te mengen.OPMERKING: Het werken met fotoschakelbare verbindingen vereist aanpassing van de verlichting om foto-isomerisatie terug te voorkomen. Het uitschakelen van het licht in steriele kasten wordt aanbevolen. Verkrijg de eindconcentraties van de verbindingen in putten (5-150 μM) door telkens 100 μL van de bereide oplossingen over te brengen in 56 putten met 100 μL eerder toegevoegde DMEM. Voeg elke keer 100 μL DMEM toe in vier putten om als negatieve controle te dienen. Dekplaten af met aluminiumfolie of plastic beschermende niet-transparante afdekking om ongecontroleerde fotoswitching te voorkomen. Plaats de platen in een celkweekincubator bij 37 °C (met daaronder extra plastic plaatdeksels) voor de gekozen incubatietijd (10 min, 60 min, 24 h of 72 h). 2D-celkweekexperiment – kleuring en beeldvorming (dag 2-5)Voeg na incubatie met verbindingen gedurende verschillende perioden 50 μL van de kleuringsoplossing per put toe aan de platen die gedurende 10 en 60 minuten met verbindingen zijn geïncubeerd. Incubeer de platen bij 37 °C gedurende 20 min.OPMERKING: Bereid voorraadkleuringsoplossingen per tijdstip door 8 μL 20 mM Hoechst 33342-oplossing (eindconcentratie is 5 μM), 32,5 μL 1 mM propidiumjodide (PI)-oplossing (eindconcentratie) en 650 μL niet-steriele FBS toe te voegen aan 5.810 μL niet-steriele 1x PBS. Verwarm FBS en PBS voor in een waterbad bij 37 °C om te voorkomen dat de cellen een temperatuurschok ervaren. Voer geautomatiseerde fluorescentiebeeldvorming uit met behulp van een 20x objectieflens. Herhaal dezelfde kleurings- en beeldvormingsprocedure (stappen 1.4.1 -1.4.2) voor de platen die gedurende 24 (dag 3) en 72 (dag 5) met verbindingen zijn geïncubeerd.OPMERKING: Typische 2D-plaatkaarten worden weergegeven in figuur 2. 3D-celkweekexperiment – zaaien van de cellen (dag 1)OPMERKING: De stappen voor deze sectie zijn identiek aan die beschreven voor de 2D-experimentvoorbereiding van de celcultuur, incubatie met de geteste verbindingen en beeldvorming (stappen 1.1-1.4.) In dit geval worden de cellen echter bereid als compacte volwassen sferoïden in een 384-well ultra-low adhesion U-bodemplaat met zwarte, niet-transparante wanden. Met behulp van een plaat van deze grootte kunnen twee verbindingen in één experiment worden vergeleken.Herhaal stap 1.2.1-1.2.9 van het 2D-experimentprotocol met een LLC-celcultuur. Bereid na het tellen van de cellen 25 ml van de celsuspensie voor. Zaai 1.000 cellen per put in alle putten in 50 μL DMEM in een 384-put, laagbindende U-bodemplaat. Centrifugeer op 40 × g gedurende 30 s en schud met een plaatschudder bij 250 tpm gedurende 1 minuut om de cellen van de wanden van de putten naar de bodem te schudden. Plaats de platen in een incubator bij 37 °C en 5% CO2 bovenop extra plastic plaatdeksels om ongelijke verwarming van de plaatbodem gedurende 48 uur te voorkomen. 3D-celkweekexperiment – toevoegen van de verbindingen (dag 3)Controleer de cellen in platen door middel van microscopie om er zeker van te zijn dat er compacte volwassen sferoïden zijn gevormd. Bereid een seriële verdunning van bestudeerde verbindingen in polypropyleen geautoclaveerde heldere platen. Neem in dit geval een extra verbinding op. Maak de volgende oplossingen voor individuele tijdpuntmetingen:Om 175 μM- en 350 μM-oplossingen van gramicidin S te verkrijgen, voegt u 1,8 μL stockoplossing toe aan 198,2 μL DMEM en voegt u 3,6 μL voorraad toe aan 196,4 μL DMEM dienovereenkomstig. Om 175 μM- en 350 μM-oplossingen van LMB002, “ring-open”-vorm te verkrijgen, voegt u 1 μL stockoplossing van 40 mM toe aan 199 μL DMEM en voegt u 1,8 μL voorraad toe aan 198,2 μL DMEM dienovereenkomstig. Om 350 μΜ- en 1.750 μM-oplossingen van LMB002, “ring gesloten” vorm te verkrijgen, voegt u 1,8 μL 40 mM stamoplossing toe aan 198,2 μL DMEM en voegt u 8,8 μL voorraad toe aan 191,2 μL DMEM dienovereenkomstig. Voer drie extra replicaties uit om vier sets van elk concentratiepunt te verkrijgen. Verkrijg seriële verdunningen door 20 μL uit elk startputje op te zuigen, het over te brengen naar de put, met 180 μL DMEM, en grondig te mengen.OPMERKING: Het werken met fotoschakelbare verbindingen vereist aanpassing van de verlichting om foto-isomerisatie terug te voorkomen. Het uitschakelen van de lichten in steriele kasten wordt aanbevolen. Verkrijg de uiteindelijke concentraties van verbindingen in putten door telkens 20 μL van de bereide oplossingen over te brengen in 128 putten die 50 μL DMEM bevatten. Voeg elke keer 20 μL DMEM toe in drie putten om als controle te dienen. Bedek de platen met aluminiumfolie of plastic beschermhoes om fotoschakeling of verdamping te voorkomen. Plaats de platen in een celkweekincubator op plastic plaatdeksels voor de gekozen incubatietijd. 3D-celkweekexperiment – kleuring en beeldvorming (dag 3-6)Bereid de kleuringsoplossing per tijdstip door toevoeging van 13 μL calceïne AM-oplossing (eindconcentratie is 1 μM), 22 μL 20 mM Hoechst 33342-oplossing (eindconcentratie is 33 μM), 40 μL 1 mM PI-oplossing (eindconcentratie is 3 μM), 300 μL niet-steriele FBS aan 2,625 μL niet-steriele 1x PBS. Verwarm FBS en PBS voor in een waterbad bij 37 °C om te voorkomen dat de cellen een temperatuurschok ervaren. Voeg na incubatie gedurende verschillende perioden met de verbindingen 20 μL van de kleuringsoplossing per put toe aan de putten die gedurende 10 minuten met verbindingen zijn geïncubeerd. Incubeer bij 37 °C gedurende 2 uur. Voer confocale fluorescentiebeeldvorming uit met een 20x objectieflens. Herhaal dezelfde kleurings- en beeldvormingsprocedure voor putten die gedurende 24 (dag 4) en 72 (dag 6) met verbindingen werden geïncubeerd.OPMERKING: In dit experiment wordt calceïne AM gebruikt als derde component van de meerkleurige kleuringsoplossing. Beelden verkregen uit 2D- en 3D-experimenten worden geanalyseerd met behulp van de geautomatiseerde beeldanalysesoftware van het instrument. Cellen die samen met Hoechst en propidiumjodidekleurstoffen zijn gekleurd, worden als necrotisch dood beschouwd en hun fractie als functie van de concentratie wordt gebruikt om de IC50-waarde te berekenen. Figuur 2: Voorbeeld van typische plaatkaarten voor de 2D-cultuurexperimenten. Kleurcodes voor de verbindingen en controle worden aangegeven. Concentraties van geteste verbindingen (aantallen in de putten) worden gegeven in μM. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. 2. Bepaling van de fotoschakelingsefficiëntie in een weefselsurrogaat Monteer de optische trein voor de monsterbestraling zoals weergegeven in figuur 3 (bestaande uit een optische kabel van de laserlichtbron, een lens met variabele brandpuntsafstand, een spuit met een niet-transparante afdekking en een vlak gesneden uiteinde).Door de brandpuntsafstand en het diafragma van de lens te veranderen, verkrijgt u een vlakke lichtbundel met een diameter die 1-1,5 mm groter is dan de binnendiameter van de gebruikte spuit, maar toch zoveel mogelijk binnen het diafragma ligt. Gebruik een spuit van 5 ml met een gesneden uiteinde en een binnendiameter van 12,4 mm en is bedekt met een niet-transparante plastic hoes. Bij een laservermogen van 200 mW stelt u de vermogensdichtheid aan de uitgang van het optische systeem in op ~103 mW/cm2 zoals gemeten met een fotometer.OPMERKING: Alle volgende bewerkingen moeten worden uitgevoerd in een verduisterde ruimte met zo min mogelijk verlichting op de werkplek. Bereid 3 ml LMB002 (“ringgesloten” vorm) stamoplossing in PBS met een concentratie van 1 mg/ml. Bereid een modelweefselmonster geladen met de inactieve fotovorm van LMB002 in een plastic container. In een typische run wordt 5 g vers gehakt varkensvlees mechanisch gemengd met 277 μL LMB002-stamoplossing en 260 μL PBS om de uiteindelijke concentratie van 50 mg / kg in het monster te bereiken, en de verhouding weefsel / PBS van ~ 9/1 (v / v). Vul de spuit met het voorbereide monster, zorg ervoor dat er geen luchtbellen in zitten, en vorm een vlak oppervlak aan het blootstellingsuiteinde (snijpunt).OPMERKING: De cilinder van het monster in de spuit moet ~40 mm langs de as beslaan. Bestraal het monster in de optische trein zoals weergegeven in figuur 3 gedurende 9 min 44 s, wat overeenkomt met ~60 J/cm2 blootstelling. Bereid 4 mm dikke plakken van het monster na de blootstelling door het met de zuiger van de spuit te duwen en het met een scalpel te snijden. Weeg en plaats de plakjes in afzonderlijke reageerbuizen en markeer ze met de gemiddelde afstand (mm) tot het bestraalde oppervlak. Bereid twee controlemonsters (optimale hoeveelheid, 0,5-0,7 g) in reageerbuizen: in het ene, gehakt gemengd met 10% (volume) PBS (54 μL), en in het andere, het modelweefselmonster verkregen in stap 2.4 bestraald door 500 mW laserlicht gedurende 10 minuten om ervoor te zorgen dat alle LMB002 “ring-gesloten” moleculen worden omgezet in de “ring-open” vorm. Voeg acetonitril-watermengsel (70%/30% v/v, aangevuld met 0,01% trifluorazijnzuur (TFA), 1,4 ml/g) toe aan elke plak en de controlemonsters. Meng de inhoud grondig met behulp van een glazen staaf. Incubeer gedurende ten minste 10 minuten bij kamertemperatuur en centrifugeer de mengsels gedurende 20 minuten bij 5220 x g of centrifugeer gedurende 30 minuten twee keer bij 20 x g om het onoplosbare materiaal te verwijderen en het supernatant te verzamelen. Verzamel de supernatanten voorzichtig (~ 0,7 ml) en centrifugeer ze opnieuw op 16.000 x g gedurende 30 minuten. Verzamel de supernatanten (~ 0,5 ml elk) en analyseer ze door omgekeerde fase high-performance vloeistofchromatografie (RP HPLC) met een analytische C18-kolom, lineaire A: B-gradiënt van 3,46% B / min, 2,0 ml / min-stroomsnelheid en 100 μL geïnjecteerd volume. Noteer de UV-gedetecteerde chromatogrammen bij 570 nm (detectie van de “ring-gesloten” vorm) en 270 nm (detectie van de “ring-open” vorm). Gebruik de niet-bestraalde (stap 2.4) en bestraalde controlemonsters (stap 2.8) om de specifieke retentietijden van beide fotovormen te bepalen (eluent A: waterig 0,1% TFA; eluent B: 90% acetonitrilwater, 0,1% TFA) en kalibreer de methode. Bepaal de werkelijke hoeveelheden LMB002-fotovormen in de geanalyseerde monsters met behulp van de kalibratiecurven die worden verkregen door de chromatogrammen van LMB002-oplossingen van bekende concentraties te nemen en te analyseren. Bereid voor kalibratie LMB002 “ringgesloten” oplossingen door de stamoplossing (stap 2.3) te verdunnen met acetonitril-watermengsel (70%/30% v/v aangevuld met 0,01% TFA) om 0,36, 0,9 en 3,6 μg per 100 μl (het geïnjecteerde volume) te verkrijgen; De eluentgradiënt en het debiet zijn hetzelfde als in stap 2.12. Herhaal het experiment (stappen 2.4-2.12) drie keer en plot het genormaliseerde percentage van elke fotovorm op de plot (percentage) versus de afstand (van het bestraalde weefseloppervlak). Bereken de statistieken (d.w.z. de standaardafwijking op elk concentratiepunt). Figuur 3: Experimentele opstelling voor het bepalen van de efficiëntie van fotoconversie in modelweefsel. (A) Schematische en (B) foto; 1, optische kabel van de laserlichtbron; 2, lens met variabele brandpuntsafstand; en 3, vleesgehakt-LMB002-fosfaat-gebufferd zoutoplossingmengsel geplaatst in 4, een spuit met een niet-transparante afdekking en gesneden voorkant (weergegeven in (B) zonder de hoes). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. 3. In vivo bepaling van de werkzaamheid tegen kanker OPMERKING: Het experimentschema en de eindpunten worden weergegeven in figuur 4. De normen voor de verzorging van dieren in de nabehandelingsperiode moeten voldoen aan de 3V-regels – huisvesting moet een goede kooidichtheid en beschikbaarheid van middelen omvatten. Houd je waar mogelijk aan niet-aversieve methoden voor het hanteren van dieren, zoals tunnel- of cupping. Figuur 4: Schema voor het in vivo therapeutisch experiment. De aanduiding van experimentele groepen, therapiedetails, eindpunten en post mortem-analyseschema’s. Afkortingen: LLC = Lewis longcarcinoom; IV = intraveneus; SC = subcutaan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Voorbereiding van de kankercellen voor subcutane inenting (dag 0).Passeer de LLC-cellen in DMEM (4,5 g / L glucose) met 10% FBS, 100 U / ml penicilline en 100 μg / ml streptomycine bij 37 ° C en 5% CO2. Oogst de cellen met behulp van 0,05% trypsine-EDTA-oplossing, centrifugeer en suspensie in serumvrije DMEM. Tel de cellen en bepaal hun levensvatbaarheid met behulp van een hemocytometer en trypan blauwe uitsluitingstest. Bereid de laatste celsuspensie met een concentratie van 10 × 106 cellen/ml in DMEM en Matrigel-mix (1:1). Houd de suspensie op ijs voor injectie. LLC celinenting (dag 0)Plaats de volwassen vrouwelijke C57BL/6NCrl-muis (met een gewicht van ~ 20 g) in de inductiekamer van het isofluraananesthesieapparaat. Voer sedatie uit op 5% isofluraan en wacht tot het dier volledig bewusteloos is. Verwijder de vacht uit het gebied van celinenting door te scheren. Ent 5 × 105 LLC-cellen in ~ 100 μL DMEM: Matrigel (1: 1) mengsel in de rechter achterpoot.OPMERKING: Houd u waar mogelijk aan de praktijk voor het gebruik van één naald. Toediening van verbindingen en fotoirstralingOPMERKING: In 5-8 dagen na inenting zijn de dieren klaar voor behandeling wanneer hun tumoren voelbaar zijn en ~ 50-100 mm3 volume hebben bereikt. Voer alle volgende bewerkingen uit met LMB002 en muizen die met deze verbinding zijn behandeld onder halfdonkere omstandigheden (één LED-lamp van 4 W op ten minste 5 m van de werkplek).Los LMB002 (“ringgesloten” vorm) op in steriele fysiologische zoutoplossing in een concentratie van 1 mg/ml voor de dosis van 5 mg/kg (IV) om donkerblauwe homogene oplossingen te verkrijgen. Stel vóór de bestraling willekeurig vier groepen van acht dieren samen en verwijder de vacht uit de tumor en nabijgelegen gebieden door te scheren. Plaats een muis in de houder voor IV-injecties en verwarm de staart van het dier in een waterbad bij 37 °C om de staartader zichtbaar te maken.OPMERKING: Overweeg preoperatieve analgesie. Injecteer de verbinding met 5 ml / kg in de staartader. Injecteer voor de twee controlegroepen 100 μl zoutoplossing (intraveneus) per dier (20 g lichaamsgewicht). Zorg ervoor dat de dieren in de twee experimentele groepen de geteste verbinding in de inactieve fotovorm (1 mg/ml in zoutoplossing) ontvangen.OPMERKING: Houd u waar mogelijk aan de praktijk voor het gebruik van één naald. Plaats vervolgens 2 h 45 min na de injectie van de verbinding de muis onder narcose. Induceer sedatie met 3%-4% isofluraan in zuurstof. Handhaaf de anesthesie gedurende 15 minuten met 0,5% -1% isofluraan in zuurstof. Bedek de muis met een zwart masker met een gat dat alleen het tumorgebied aan het licht blootstelt. Schakel de laserdiodemodule in met een laser van 650 nm en stel het vermogen van de rode laser in op 200 mW en de blauw/UV-geleidingslaser op 2 mW.OPMERKING: Gebruik een blauwe beschermende bril wanneer het laserapparaat is ingeschakeld. Meet de lichtstroom van de rode laser (weg van de muizen) met een fotometer en bepaal de afstand tot de optische kabel waar de lichtstroom 100 mW/cm2 is. Bevestig de kabel op een standaard om ervoor te zorgen dat de lichtbron zich op de bepaalde afstand van de tumor bevindt en dat het licht het hele tumorgebied bedekt. Gebruik blauw/UV-geleidingslaserlicht tijdens deze procedure. Schakel de rode laser in om het tumorgebied gedurende 20 minuten te bestralen. Schakel na de bestraling de isofluraanstroom uit, breng het dier terug naar zijn kooi en observeer de toestand ervan gedurende de volgende 30 minuten zorgvuldig.OPMERKING: Houd de muizen na toediening van de verbinding gedurende 2 dagen in het donker. Alleen de lichtdagcyclus moet worden gewijzigd; Alle andere woonomstandigheden moeten ongewijzigd blijven. NabehandelingsobservatiesObserveer de dieren dagelijks en meet het gewicht en de afmetingen van hun tumoren. Meet het tumorvolume en noteer de progressie van de necrose.OPMERKING: De normen voor de verzorging van dieren in de nabehandelingsperiode moeten voldoen aan de 3V-regels – huisvesting moet een goede kooidichtheid en beschikbaarheid van middelen omvatten. Gebruik gegevens die in de vorige stap zijn verzameld om de mortaliteit te evalueren. Bepaal de overlevingskans met behulp van de standaardprocedure.OPMERKING: Dieren moeten worden geofferd en als dood worden geteld bij het onthullen van ernstige klinische symptomen (verlies van lichaamsgewicht van meer dan 15%, tumorzweren geneest niet binnen 7 dagen en vocalisatie) of zodra het tumorvolume 2.500mm 3 bereikt.