光控生物活性化合物的体外和体内评价 - 癌症光药理学的潜在候选药物
Summary
该协议提供了一组用于评估可光开关抗癌肽的实验，可用于此类化合物的临床前筛选。这包括 2D 和 3D 细胞培养物中的细胞毒性评估、 离体 （模型组织）光异构化效率和 体内 功效的评估。
Abstract
光控生物活性化合物是一类新兴的“智能”候选药物。它们通过将良性的、不可电离的光引导到患者体内的特定位置，在全身化疗中提供了额外的安全性，因为它们具有精确的时空激活。本文提出了一套评估光控生物活性化合物光活化的 体外 效力和 离体 效率以及药物开发早期阶段 体内功效的方法 。该方法应用于抗癌细胞毒性肽，即已知抗生素短杆菌肽的含二芳基乙烯的类似物。实验使用癌细胞系（刘易斯肺癌，LLC），活组织替代物（猪肉肉末）和同种异体移植癌症模型（皮下LLC）的2D（贴壁细胞）和3D（球状体）细胞培养物在免疫活性小鼠中进行。通过自动荧光显微镜选择最有效的化合物和估计真实的光疗窗口。在模型组织中的不同深度确定不同照明方案下的光活化效率，并在最终的 体内 治疗实验中应用最佳光剂量。
Introduction
近几十年来，光控生物活性化合物已成为人类疾病安全化学疗法和特异性根除恶性实体瘤的有前途的组成部分1。这些化合物含有可逆的光异构化片段（分子光开关），并且可以在用不同波长的光照射时在非活性和活性光异构体之间切换。
与其不可光控的类似物相比，光对照药物可能更安全，因为它们可以以活性较低且基本上无毒的形式全身引入患者体内，然后仅在必要时被光激活，例如在肿瘤、溃疡和伤口中。尽管在最近的学术论文2,3,4,5,6,7中可以找到这种分子药物原型的多个令人兴奋的演示，但临床光药理学领域 – 批准的药物/医疗设备/疾病组合的应用 – 并不存在。光药理学尚处于药物发现阶段，系统的临床前研究尚不清楚。
我们直到最近才证明了一些光控抗癌肽的 体内 安全优势，即肽抗生素短杆菌肽S8的类似物。这些光控衍生物含有二芳基乙烯（DAE）光开关，其在所谓的红光产生的“环开”和紫外线产生的“闭环”光形式之间经历可逆的光诱导转化（ 图1 所示为其中一种衍生物化合物LMB002）。
图1：光控细胞毒性肽LMB002及其光异构化。 二芳基乙烯片段以红色显示。缩写：DAE = 二芳基乙烯。 请点击此处查看此图的大图。
寻找命中并进行命中到先导物优化通常需要对适当的化合物库进行体外和体内筛选 9,10。在这里，我们展示了一种适用于光控化合物细胞毒性的系统高通量筛选的方法。我们还确定光异构化效率，估计模型组织中的光剂量，并评估表现最佳的候选药物的体内功效。该方法符合生物伦理学和动物护理方面的考虑。
在这项工作中，对传统的临床前方法进行了修改，以避免测试化合物的不受控制的光异构化。在这里应用这些改进方法的总体目标是开发一种通用策略，该策略简单，快速，并产生具有统计学意义的数据，以可靠地比较 体外 活性，并使可光开关化合物的 体内 功效测试合理化，以进行先导物鉴定和进一步开发。
该策略由三个连续步骤组成。第一步涉及使用二维（2D，单层）和三维（3D，球状体）细胞培养物和共聚焦高通量自动荧光显微镜连续稀释所选光控生物活性化合物的活性和非活性光型的IC 50（表观50 %细胞活力）。将光处理窗口与两种光型之间的IC50 差异进行比较，并选择性能最佳的候选窗口。通过自动显微镜和其他细胞毒性筛查平台（测定）进行毒性评估没有特异性优势11;更复杂的基于细胞的肿瘤模型12 可以在这个阶段容易地实现。
对于在步骤1中选择的化合物，第二步是通过使用紫外检测高效液相色谱（HPLC）量化组织替代物中活性较低的光型的光开关效率，以实际估计其在组织内的光切换效率作为辐照组织表面深度的函数。 在体内 ，可以研究光开关效率，但我们建议使用简单的组织替代物 – 碎猪肉。我们已经测试了这种方法的有效性。我们在小鼠癌症 模型上测量 了体内光开关化合物的转化率，并在先前的小鼠实验中测量的深度观察到大致相同的光转换8。可以使用任何合适的替代人造组织13、3D生物打印组织/器官14、活检材料或其他豁免动物材料。但是，此设置是一个很好的折衷方案，因为它经济、快速且合乎道德。
第三步是确定小鼠癌症模型中的 体内 抗癌功效。本实验选择在 体外 实验中表现出优异特性的化合物，并在模型组织中至少1-1.5cm的深度进行有效的光切换。
该方案可以应用于具有不同类型光开关的化合物，前提是它们的光型（或其光静止态，PSS）在合理的时间内（几天或更长时间）稳定。为了说明，使用了前面描述的DAE派生的LMB00215。LMB002光型具有热稳定性，可以在-20°C下储存至少一年而不会发生实质性降解。选择刘易斯肺癌（LLC）细胞进行体外和体内演示，但对细胞类型没有限制。LLC细胞是贴壁的，易于在3D中培养，并用于产生类肿瘤（如参考文献16中所述）。体内LLC细胞用于模拟转移过程，并且可以在皮下注射后容易在免疫活性小鼠中产生实体瘤。这种体内方法可以普遍应用于其他癌症模型17,18。该战略的详细实施情况如下所述。
Protocol
动物护理和实验程序按照当地和国际法规进行涉及实验动物的研究项目（乌克兰“保护动物免受虐待”法，欧洲保护用于实验和其他科学目的的脊椎动物公约（欧洲公约，斯特拉斯堡，1986年），关于保护用于科学目的的动物的指令2010/63 / EU）。这项研究得到了比恩塔公司生物伦理委员会的批准。在这些实验中使用C57BL / 6NCrl小鼠（每只重约20g的成年雌性）。具体材料、试剂和设备列在 材料表中。 1. 使用 2D 和 3D LLC 细胞培养物对 LMB002（“闭环”和“环开”形式）进行 IC50 评估 化合物缓冲液和储备溶液的制备注意：使用标准程序准备缓冲液。或者，使用市售解决方案。通过将 14.2 g Na 2 HPO 4、2.4 g KH 2 PO4、80 g NaCl 和2g KCl 加入 1 L 蒸馏水中制备 10x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS）。高压釜制备10x PBS，并通过将100 mL的10x溶液加入900 mL蒸馏水将其稀释至1x溶液。然后，将溶液储存在4°C。 通过将 4.78 克 DPBS 粉末加入 1 L 蒸馏水中来制备 Dulbecco 的 PBS （DPBS）。搅拌溶液直至所有固体溶解，使用pH计检查pH值，并通过添加1M NaOH或1M HCl（pH 7.3-7.4）进行调整。达到所需的pH值后，通过无菌柜中的0.22μm真空过滤器过滤培养基。储存在4°C。 通过将238.3gHEPES加入1L蒸馏水中制备1M 4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙烷磺酸（HEPES）缓冲溶液。用1M NaOH调节溶液的pH值，直到pH 7.5。通过无菌柜中的0.22μm真空过滤器过滤。储存在4°C。 通过稀释10x溶液制备1x胰蛋白酶-EDTA（EDTA =乙二胺四乙酸）溶液。为此，在 50 mL 无菌管中将 5 mL 10x 胰蛋白酶-EDTA 加入 45 mL 1x PBS 溶液中。储存在4°C。 在带有磁力搅拌棒的测量筒中加入 13.4 克 DMEM 高葡萄糖粉和 3.7 克 Na2CO3 至 1 L 蒸馏水，制备 Dulbecco 的改良鹰培养基 （DMEM） 碱性。搅拌溶液直至所有固体溶解，使用pH计检查pH值，并通过添加1M NaOH或1M HCl（pH 7.3-7.4）进行调整。达到所需的pH后，通过无菌柜中的0.22μm真空过滤器过滤培养基并储存在4°C。 通过将 100 mL 胎牛血清 （FBS）、10 mL 青霉素-链霉素溶液、10 mL L-谷氨酰胺溶液和 10 mL 1 M HEPES 缓冲液加入 900 mL DMEM 碱性 DMEM 缓冲液中制备 DMEM 完全培养基。储存在4°C。 为测试化合物准备储备溶液。对于每种化合物，称取环闭光型中的两批 5.12 mg（例如 LMB002）到两个 1.5 mL 微量离心管（一个具有透明壁，另一个具有黑色不透明壁）中。在超透明壁管中称取 2.28 mg 阳性对照（例如短杆菌肽 S）。向每个样品中加入 100 μL 纯 DMSO 并涡旋 30 秒。 通过涡旋照射溶液，将透明壁管中的储备溶液 （LMB002） 从“环闭”形式光异构化为“环开”形式，以确保充分混合。继续，直到颜色明显从深紫色变为浅棕色。使用铝箔避光。 2D细胞培养实验-接种细胞（第1天）将 10 mL DMEM 完全培养基从装有 LLC 细胞培养物的 T-75 烧瓶转移到 15 mL 无菌管中。用真空泵吸出剩余的培养基。 用 5 mL 的 1x DPBS 洗涤细胞培养物，并用真空泵吸出溶液。 用3mL的1x胰蛋白酶-EDTA溶液覆盖细胞，并将烧瓶在37°C的5%CO 2气氛中孵育2-3 分钟。 通过将 6 mL DMEM 培养基（先前转移到无菌管中）加入含有 1x 胰蛋白酶-EDTA 溶液的细胞培养瓶中并移液悬浮液数次以将细胞从细胞培养瓶壁上洗掉来停止胰蛋白酶作用。 将悬浮液转移到 15 mL 管中，并以 200 × g 离心 4 分钟。离心后，用真空泵吸出上清液。避免接触管底部的细胞沉淀。 通过加入 2 mL 新鲜 DMEM 完全培养基并移液数次重悬细胞。 通过将约 15 μL 悬浮液采样到 0.5 mL 管中，加入 15 μL 0.4% 台盼蓝，然后将获得的混合物转移到细胞计数室中来计数细胞。 计数后，每个时间点准备25mL细胞悬液。在 200 μL DMEM 中接种 5,000-10,000（平均 8,000 个）LLC 细胞/孔，该孔位于具有透明底部和黑色不透明壁的 96 孔的中心 60 孔中。用纯DMEM填充剩余的36个孔。 将板置于细胞培养箱中，在37°C和5%CO 2下过夜。 在下面使用塑料板盖，以防止底板加热不均匀。 2D 细胞培养实验 – 添加化合物（第 2 天）通过平板中的光学显微镜监测细胞，直到细胞达到70%-80%汇合度。 在无菌柜中用真空泵从孔中吸出培养基。加入 100 μL 新鲜预热的 DMEM 培养基，并将板放入细胞培养箱中。 在聚丙烯高压灭菌的透明板中制备测试化合物的连续稀释液和阳性对照。为单个时间点测量制定以下解决方案：注意：从DMSO中的储备开始，用DMEM稀释，但不要超过最终最高浓度DMSO的1% v / v。要获得 128 μM 的短杆菌肽 S 溶液，请将 1.3 μL 20 mM 储备溶液添加到 198.7 μL DMEM 中。 要获得 256 μM LMB002 溶液（“环开”形式），请将 1.3 μL 40 mM 溶液添加到 198.7 μL DMEM 中。 要获得 512 μM LMB002 溶液（“环闭合”形式），请将 2.6 μL 40 mM 储备溶液添加到 197.4 μL DMEM 中。 执行三次额外的重复以获得四组每个浓度点。通过从每个起始孔中吸出 100 μL，转移到装有 100 μL DMEM 的孔中并充分混合来制备双稀释系列。注意：使用可光开关化合物需要调整照明以防止反向光异构化。建议关闭无菌柜中的灯。 通过在 56 孔中每次转移 100 μL 制备的溶液，用 100 μL 先前添加的 DMEM 获得孔中化合物的最终浓度 （5-150 μM）。每次在四个孔中加入 100 μL DMEM 作为阴性对照。 盖板用铝箔或塑料保护性非透明盖，以防止不受控制的光开关。将板置于37°C的细胞培养箱中（使用额外的塑料板盖下），选择孵育时间（10分钟，60分钟，24小时或72小时）。 2D 细胞培养实验 – 染色和成像（第 2-5 天）与化合物孵育不同周期后，每孔向与化合物孵育10和60分钟的板中加入50μL染色溶液。将板在37°C孵育20分钟。注意：通过向 5,810 μL 非无菌 1x PBS 中加入 8 μL 20 mM Hoechst 33342 溶液（终浓度为 5 μM）、32.5 μL 1 mM 碘化丙啶 （PI） 溶液（终浓度为 1 μM）和 650 μL 非无菌 FBS 在每个时间点制备储备染色溶液。在37°C的水浴中预热FBS和PBS，以防止细胞经历温度冲击。 使用20倍物镜进行自动荧光成像。 对与化合物孵育24（第3天）和72（第5天）小时的平板重复相同的染色和成像程序（步骤1.4.1-1.4.2）。注意：典型的 2D 板图如图 2 所示。 3D细胞培养实验 – 接种细胞（第1天）注意：本节的步骤与细胞培养物的2D实验制备，与测试化合物的孵育和成像（步骤1.1-1.4）的步骤相同。然而，在这种情况下，细胞在具有黑色，不透明壁的384孔超低粘附U型底板中制备为紧凑的成熟球状体。使用这种尺寸的板可以在一个实验中比较两种化合物。用LLC细胞培养物重复2D实验方案中的步骤1.2.1-1.2.9。 计数细胞后，准备 25 mL 细胞悬液。在 384 孔、低结合、U 型底板中的所有孔中接种 1,000 个细胞，放入 50 μL DMEM 中。 以40 ×g 离心30秒，并用摇板器以250rpm摇动1分钟，将细胞从孔壁上摇到底部。 将板置于37°C和5%CO2 的培养箱中，放在额外的塑料板盖顶部，以防止板底不均匀加热48小时。 3D 细胞培养实验 – 添加化合物（第 3 天）通过显微镜监测平板中的细胞，以确保形成致密的成熟球体。 在聚丙烯高压灭菌的透明板中制备所研究化合物的系列稀释液。在这种情况下，包括一个额外的化合物。为单个时间点测量制定以下解决方案：要获得 175 μM 和 350 μM 的短杆菌肽 S 溶液，请将 1.8 μL 20 mM 储备溶液添加到 198.2 μL DMEM 中，并相应地向 196.4 μL DMEM 中添加 3.6 μL 储备液。 要获得 175 μM 和 350 μM LMB002 溶液（“环开”形式），请将 1 μL 40 mM 储备溶液添加到 199 μL DMEM 中，并相应地向 198.2 μL DMEM 中添加 1.8 μL 储备液。 要获得 350 μΜ 和 1,750 μM LMB002 溶液（“环闭合”形式），请将 1.8 μL 40 mM 储备溶液添加到 198.2 μL DMEM 中，并相应地向 191.2 μL DMEM 中添加 8.8 μL 储备液。 执行三次额外的重复以获得四组每个浓度点。通过从每个起始孔中提取 20 μL，用 180 μL DMEM 将其转移到孔中并充分混合来获取连续稀释液。注意：使用可光开关化合物需要调整照明以防止反向光异构化。建议关闭无菌柜中的灯。 通过在含有 50 μL DMEM 的 128 个孔中每次转移 20 μL 制备的溶液，获得孔中化合物的最终浓度。每次在三个孔中加入 20 μL DMEM 作为对照。用铝箔或塑料保护罩覆盖板，以防止光开关或蒸发。 将板放入塑料板盖上的细胞培养箱中，等待所选的孵育时间。 3D 细胞培养实验 – 染色和成像（第 3-6 天）通过向 13 μL 1 mM 钙黄绿素 AM 溶液（终浓度为 1 μM）、22 μL 20 mM Hoechst 33342 溶液（终浓度为 33 μM）、40 μL 1 mM PI 溶液（终浓度为 3 μM）、300 μL 非无菌 FBS 到 2,625 μL 非无菌 1x PBS 中，在每个时间点制备染色溶液。在37°C的水浴中预热FBS和PBS，以防止细胞经历温度冲击。 与化合物孵育不同时间后，每孔向与化合物孵育10分钟的孔中加入20μL染色溶液。在37°C孵育2小时。 使用20倍物镜进行荧光共聚焦成像。 对与化合物一起孵育24（第4天）和72（第6天）小时的孔重复相同的染色和成像程序。注意：在本实验中，钙黄绿素AM用作多色染色溶液的第三种成分。使用仪器的自动图像分析软件分析从2D和3D实验中获得的图像。用Hoechst和碘化丙啶染料共染色的细胞被认为是坏死的，它们的分数作为浓度的函数用于计算IC50 值。 图 2：2D 培养实验的典型板图示例。标明了化合物和对照的颜色代码。测试化合物的浓度（孔内的数量）以μM为单位。 请点击此处查看此图的大图。 2. 组织替代物中光开关效率的测定 如图 3 所示组装用于样品照射的光学序列（由来自激光光源的光缆，具有可变焦距的透镜，带有非透明盖的注射器和扁平切割端组成）。通过改变镜头的焦距和孔径，获得直径比所用注射器内径大1-1.5毫米的平光束，但尽可能多地保持在孔径内。 使用5 mL注射器，切口端，内径为12.4 mm，并覆盖有不透明的塑料盖。在激光功率输出为 200 mW 时，将光学系统输出端的功率密度设置为 ~103 mW/cm2 ，用光度计测量。注意：所有后续操作必须在黑暗的房间内进行，尽可能减少工作场所的照明。 在 PBS 中制备 3 mL LMB002（“闭环”形式）储备溶液，浓度为 1 mg/mL。 在塑料容器中制备装有LMB002的非活性光型的模型组织样品。在典型运行中，将 5 g 新鲜碎猪肉与 277 μL LMB002 储备溶液和 260 μL PBS 机械混合，以达到样品中 50 mg/kg 的最终浓度，组织/PBS 的比例为 ~9/1 （v/v）。 用准备好的样品填充注射器，确保内部没有气泡，并在曝光（切割）端形成平坦的表面。注意：注射器中样品的圆筒必须沿轴占据~40毫米。 如图 3 所示在光学序列中照射样品9分44秒，对应于~60 J / cm2 曝光。 暴露后，使用活塞将其从注射器中推开并用手术刀切割，准备4毫米厚的样品切片。称量切片并将其放入单独的试管中，并通过距辐照表面的平均距离（mm）进行标记。 在试管中制备两个对照样品（最佳量，0.5-0.7 g）：一个是肉末与 10%（体积）PBS （54 μL） 混合，另一个是步骤 2.4 中获得的模型组织样品用 500 mW 激光照射 10 分钟，以确保所有 LMB002“闭环”分子转化为“环开”形式。 向每个切片和对照样品中加入乙腈-水混合物（70%/30% v/v，补充有 0.01% 三氟乙酸 （TFA），1.4 mL/g）。用玻璃棒彻底混合内容物。 在室温下孵育至少10分钟，然后将混合物以5220×g离心20分钟或以20×g离心30分钟两次以除去不溶性物质并收集上清液。 小心收集上清液（~0.7mL），并以16,000 ×g 再次离心30分钟。 收集上清液（每个~0.5 mL）并通过反相高效液相色谱（RP HPLC）进行分析，分析C18色谱柱，线性A：B梯度为3.46% B / min，流速为2.0 mL / min，进样体积为100 μL。记录570nm（检测“环闭合”形式）和270nm（检测“环开”形式）的紫外检测色谱图。使用非辐照（步骤2.4）和辐照对照（步骤2.8）样品确定两种光型（洗脱液A：水溶液0.1%TFA;淋洗液B：90%乙腈水，0.1%TFA）的特定保留时间并校准方法。 使用通过获取和分析已知浓度的LMB002溶液的色谱图获得的校准曲线，确定分析样品中LMB002光型的实际量。为了进行校准，通过用乙腈-水混合物（70%/30% v/v / v补充有0.01%TFA）稀释储备溶液（步骤2.3）来制备LMB002“环闭”溶液，以获得每100μL（进样体积）0.36,0.9和3.6μg;淋洗液梯度和流速与步骤2.12相同。 重复实验（步骤2.4-2.12）三次，并在图上绘制每种光型的归一化百分比（百分比）与距离（从照射的组织表面）。计算统计数据（即每个浓度点的标准偏差）。 图3：用于确定模型组织中光转换效率的实验装置。 （A） 示意图和 （B） 照片; 1、光缆来自激光光源; 2、镜头具有可变焦距; 和3，将肉末-LMB002-磷酸盐缓冲盐水混合物置于 4中，注射器用不透明的盖子和切开前端（如（B）所示没有盖子）。 请点击此处查看此图的大图。 3. 体内 抗癌疗效测定 注意：实验计划和终点如图 4 所示。处理后阶段的动物护理标准应符合3R规则 – 饲养应包括适当的笼子密度和资源可用性。尽可能坚持非厌恶的动物处理方法，如隧道或拔罐。 图4： 体内 治疗实验的时间表。 实验组的名称、治疗细节、终点和 尸检 分析时间表。缩写：LLC = 刘易斯肺癌;IV = 静脉注射;SC = 皮下。 请点击此处查看此图的大图。 准备用于皮下接种的癌细胞（第0天）。在 37 °C 和 5% CO2 下用 10% FBS、100 U/mL 青霉素和 100 μg/mL 链霉素传代 DMEM（4.5 g/L 葡萄糖）中的 LLC 细胞。 使用 0.05% 胰蛋白酶-EDTA 溶液收获细胞，离心并悬浮在无血清 DMEM 中。 计数细胞并使用血细胞计数器和台盼蓝排除试验确定其活力。 在DMEM和基质胶混合物（1：1）中制备浓度为10×106 个细胞/ mL的最终细胞悬液。注射前将悬浮液保持在冰上。 LLC细胞接种（第0天）将成年雌性C57BL / 6NCrl小鼠（重量~20g）置于异氟烷麻醉机的诱导室中。在5%的异氟醚下进行镇静，等到动物完全失去知觉。 通过剃须从细胞接种区域去除皮毛。 将 5 × 105 LLC 细胞接种在 ~100 μL DMEM：基质胶 （1：1） 混合物中放入右后肢。注意：尽可能坚持单针使用习惯。 化合物给药和光照射注意：在接种后5-8天内，当动物的肿瘤可触及并达到~50-100mm3 体积时，动物已准备好接受治疗。在半黑暗条件下（距离工作场所至少5m的一个4W LED灯）使用LMB002和由该化合物处理的小鼠执行所有后续操作。将LMB002（“环闭合”形式）溶解在浓度为1mg / mL的无菌生理盐水中，剂量为5mg / kg （IV），以获得深蓝色均匀溶液。 在照射之前，随机组装四组八只动物，并通过剃须从肿瘤和附近区域去除皮毛。 将小鼠放在支架中进行IV注射，并在37°C的水浴中预热动物的尾巴，以使尾静脉可见。注意：考虑术前镇痛。 以 5 mL/kg 的速度将化合物注入尾静脉。对于两个对照组，每只动物（20 g 体重）注射 100 μL 盐水（静脉内）。确保两个实验组中的动物以非活性光形式（1mg / mL盐水）接受测试化合物。注意：尽可能坚持单针使用习惯。 然后，在注射化合物后2小时45分钟，将小鼠置于麻醉下。用3%-4%异氟醚在氧气中诱导镇静。用0.5%-1%异氟醚在氧气中保持麻醉15分钟。 用黑色面罩覆盖鼠标，该面罩有一个孔，仅将肿瘤区域暴露在光线下。 用 650 nm 激光器打开半导体激光管模块，并将红色激光器的功率设置为 200 mW，将蓝色/UV 引导激光器的功率设置为 2 mW。注意：激光设备打开时，请使用蓝色防护眼镜。 用光度计测量来自红色激光（远离小鼠）的光通量，并确定光通量为100 mW / cm2的光缆的距离。将电缆固定在支架上，以确保光源与肿瘤的距离确定，并且光线覆盖整个肿瘤区域。在此过程中使用蓝色/紫外线引导激光。 打开红色激光照射肿瘤区域20分钟。 照射后，关闭异氟醚流，将动物放回笼子，并在接下来的30分钟内仔细观察其状况。注意：化合物给药后，将小鼠置于黑暗中2天。只有光日周期必须改变;所有其他住房条件应保持不变。 处理后观察每天观察动物并测量其肿瘤的重量和尺寸。测量肿瘤体积并注意坏死的进展。注意：后处理期间的动物护理标准应符合3R规则 – 饲养应包括适当的笼子密度和资源可用性。 使用上一步中收集的数据来评估死亡率。使用标准程序确定存活率。注意：当显示严重的临床症状（体重减轻超过15%，肿瘤溃疡在7天内不愈合，发声）或肿瘤体积达到2,500mm3时，应处死动物并算作死亡。
Representative Results
在这项工作中，进行了2D和3D细胞实验，以确定在不同孵育时间下LMB002的“闭环”和“开环”形式的IC50 （见 图1）。将这些值与原型肽短杆菌肽S（用作阳性对照）获得的值进行比较。染色后在2D生长的LLC培养物中孵育的典型图像集如图 5所示。与Hoechst 33342（蓝色）和碘化丙啶（红色）共染色，在“环开”形式处理的情况下，与“环闭合”形式相比，在更大比例的细胞中产生不同深浅的紫色表明两种形式之间的细胞毒性存在明显差异，可以很容易地量化。成功实验的演示示例基于使用96孔板格式收集的数据，其中添加了不同浓度的肽变体，如图 2所示。使用384孔和高密度板可以获得类似的数据。然而，由于每孔体积减少，技术和系统误差以及IC50 测定的准确性将随着孔密度的增加而降低。 图 5：来自单层生长的 LLC 中细胞毒性测定的代表性图像。 细胞用Hoechst 33342（蓝色）和碘化丙啶（红色）染色。显示的时间：10分钟，60分钟，24小时和72小时是化合物的孵育时间。比例尺 = 50 μm。 请点击此处查看此图的大图。 使用由肉末与溶解在PBS中的LMB002“环闭合”（非活性）形式混合的样品确定LMB002在模型组织 – 新鲜猪肉末 – 中的激光照射的光转化，并测量这种非活性形式在辐射传播方向上向LMB002“环开”（活化）形式的转化。将样品置于注射器中，用扁平激光束从一侧照射，曝光时间为~10分钟（通常用于 体内 实验），如图 3所示。曝光后，通过按下注射器活塞并用手术刀切割相同高度的切片将样品筒分成几部分。使用RP HPLC测定切片提取物中LMB002“开环”的浓度。 图6说明了从数据分析中获得的图6A-D的剂量效应曲线。为了鉴定Hoechst 33342和PI染料的核共染色死细胞的百分比，我们使用了一个内置的分类工具，该工具在选定的测量参数处设置数值阈值，将所有细胞计数分为几类。例如，当对照中的红色通道（碘化丙啶）信号处于阈值（约110-130单位）时，细胞可以分类为PI阳性，被认为是死亡的，或PI阴性的，被认为是不受化合物的影响。对于LMB002，可以看到碘化丙啶阳性细胞百分比对化合物浓度的S形依赖性。根据这些数据，可以确定IC50值。 图 6：2D 培养中的细胞毒性分析。 在LLC培养物中获得的Sigmoid适合（A）10分钟，（B）60分钟，（C）24小时和（D）72小时时间间隔，用于与化合物孵育。接头可以精确确定IC50 值（未显示）。误差线是SEM。 缩写：LLC = 刘易斯肺癌;PI = 碘化丙啶。 请点击此处查看此图的大图。 考虑到获得的IC50 值，我们可以得出结论，所有三种化合物的毒性随着孵育时间的增加而增加。我们的实验表明，LMB002的“环开”形式的毒性比原型肽短杆菌肽S低约一个稀释步骤，而“环闭合”形式显示出三到四个稀释步骤的毒性较低，毒性随着孵育时间的增加而增加。两个稀释步骤之间的差异不受孵育时间增加的影响，并且可以数值用作实验确定的光治疗窗口6 ，以便与潜在文库筛选中的其他化合物进行比较。将短杆菌肽S的IC50 值设置为参考点，以纠正生物学重复中的实验误差或差异输出。 3D细胞实验产生了相同类型的原始数据 – 单细胞分辨的每孔一个球体图像。将钙黄绿素作为第三种染色染料能够定量代谢活性细胞的比例（在绿色通道中观察到）。通过使用 384 孔板，增加技术重复次数，排除冗余共孵育时间点，并改变稀释折叠，我们能够在单次测试运行（使用单板）中直接比较几种化合物，如图 7 中的板图所示。 图 7：两种化合物的 3D 培养实验的板图。标明了化合物和对照的颜色代码。孔中的数值以μM为单位。 10分钟，24小时和72小时为孵育时间。请点击此处查看此图的大图。 图8显示了在存在染色后捕获的测试化合物和对照球的情况下，以1个球/孔密度生长的LLC微球的选定技术重复图像。 图 8：来自 3D 培养细胞毒性测定的代表性图像。 图像显示48小时龄LLC球体在与LMB002光型和短杆菌素S共同孵育10分钟，24小时和72小时后用Hoechst 33342（蓝色），钙黄绿素AM（绿色）和碘化丙啶（红色）染色。 比例尺= 100μm。 请点击此处查看此图的大图。 使用仪器软件，从z堆叠的图像堆中获得剂量效应曲线，就像2D实验中的曲线一样（图9A）。此外，3D培养物中的致密和未变形的球体可以通过全球体直径来表征（图9B）。还注意到，总球体直径随化合物浓度而变化。 图 9：使用 3D 培养物进行细胞毒性评估。 （A） 浓度依赖性细胞毒性拟合曲线和 （B） 在与短杆菌肽 S 共同孵育 10 分钟、24 小时和 72 小时的 LLC 3D 培养物中获得的浓度依赖性球体直径图，并在染色前捕获。误差线为 SEM。 请点击此处查看此图的大图。 步骤2的实验允许使用紫外检测的高效液相色谱法测定两种光型中的LMB002浓度。使用这种设置可以轻松评估和量化模型组织中光转化的效率（图3）。数据是通过样品提取物色谱图的定量分析获得的。在这些测试实验中，在270 nm和570 nm处对LMB002色谱图进行了光谱检测。在270nm处，观察到许多其他信号并将其归因于从模型组织中共提取的化合物（从不含该化合物的对照提取物中验证）。两种光型在保留时间和吸光度方面存在足够的差异。然而，LMB002“开环”信号与这些背景信号基线分离（参见图 10A中的代表性色谱图）。因此，该信号可以毫无问题地集成。在570 nm处，色谱图仅包含LMB002“闭环”形式信号（图10B）。在这里，我们使用RP HPLC进行了浓度测定。然而，使用LC/MS作为分析方法可以实现更高的精度和更低的检测限。 图10：从模型组织中提取的LMB002的代表性色谱图。 （A）距离辐照表面2 mm处的样品，记录在270 nm处（集成了LMB002“环开”形式）;（B）样品在距辐照表面38毫米处，记录在570nm处（LMB002的峰“环闭合”是积分的）。保留时间值（指示）还证实了该化合物的特性。请点击此处查看此图的大图。 使用整合所有收集样品的相应信号后获得的数据来构建浓度-深度图，如图 11所示。在这些图表的基础上，很容易评估模型组织不同深度的光转化效率。它证实我们的红色光源在组织替代物碎肉（约 103 mW/cm2）中诱导深度高达 1 c 的“环闭合”LMB002 光转换。 图 11：光转换效率评估。 LMB002“环闭合”（未活化，蓝点）和“环开”形式（活化，橙色点）的浓度（A，mg / kg）与模型组织的辐照表面（L，mm）不同距离。 请点击此处查看此图的大图。 体内实验的结果 – 根据图4所示的时间表执行的方法的步骤3 – 由显示肿瘤生长作为时间函数的图表（图12）和Kaplan-Meier生存曲线（图13）表示。 图12：动物的肿瘤生长动力学。 用LMB002处理的动物与载体处理的动物相比（C57BL / 6NCrl小鼠中的皮下LLC同种异体移植模型，化合物剂量7mg / kg，IV，2小时40分钟孵育，然后在650nm，100mW / cm2,20分钟下照射）。 请点击此处查看此图的大图。 图13：动物的死亡率曲线。 用LMB002处理的动物与载体处理的动物相比（C57BL / 6NCrl小鼠中的皮下LLC同种异体移植模型，化合物剂量7mg / kg，IV，2小时40分钟孵育，然后在650nm，100mW / cm2,20分钟下照射）。 请点击此处查看此图的大图。
Discussion
光控化合物在药物开发中是前所未有的;然而，尚未建立用于其临床前和临床评估的方法。最接近的单一疗法类似物，光动力疗法（PDT），是许多国家采用的临床治疗癌症的治疗方式，并且正在开发用于其他适应症19,20。与光药理学类似，PDT也是基于使用光来激活生物活性物质（单线态氧）。因此，PDT中用于临床前和临床研究的一些实验方法可以用于光药理学。例如，光源、光输送方法和医疗设备已开发并批准用于 PDT;它们可直接用于光控药物的评价。然而，PDT和光药理学彼此有许多区别4，这证明了需要为后者建立特定方法。
首先，PDT（氧气）中的非活性物质总是以无毒浓度存在于活组织中。相比之下，未活化的光控生物活性化合物可能具有残留活性和不必要的毒性。因此，理想的光药理学药物应在其给药形式中具有最小的生物活性，并且必须在其光产生形式中具有高度活性，“光治疗窗口”21 必须尽可能大。找到命中并进行命中到先导物优化需要鉴定合适的化合物并筛选相对较大的文库，这些文库已经处于药物开发的早期阶段。在这里，我们提出了一种自动化的高通量共聚焦荧光显微镜来鉴定有效的光开关化合物。
所选择的细胞毒性评估方法可以轻松实现最关键的要求 – 维持PSS或可见光敏感光异构体的稳定性。这是因为，在实施时，光暴露被最小化。因此，如果选择替代方法，则应首选自动化方法。这种方法是可靠且信息丰富的。在此阶段使用3D细胞培养物（球状体）可以全面了解细胞在更真实的组织样微环境中对治疗的反应。此外，使用显微镜作为直接方法可以获得对化合物作用机理的宝贵见解。具有适当染色方案的共聚焦荧光显微镜允许对细胞和球体的形态进行视觉评估;还可以检测到细胞死亡和细胞内变化的重要细节。
其次，轻度应用需要仔细选择光剂量。在PDT中，光过量对组织极其有害22。光药物治疗在过度的光照射下可能是有利的。活性物质的上限由非活性物质的给药剂量及其药代动力学定义。然而，光剂量仍然是光药理学中的一个问题。应注意确保照射功率密度和曝光时间不 小于 治疗要求。原则上，可以在 体内监测活性物质的产生。然而，出于生物伦理学的原因，我们提出了一个将模型组织（新鲜的碎肉）与非活化化合物15混合的实验。这个实验很简单，可以修改为使用不同的光源。它还可以适用于光剂量的光物理估计和热影响的测量。同样，通过使用模型组织，可以将光暴露最小化，例如，与 体内 条件下更准确的光开关效率测定相比，这是一种可能总是值得考虑的替代方案。
最后，可以选择在 体外 毒性筛选中表现出优越特性并在模型组织深处至少1-1.5 cm处有效光转换的化合物进行昂贵，费力和漫长的 体内 研究。在该协议中，我们使用与 体外 评估相同的细胞系（LLC）来生成同种异体移植癌症模型。肿瘤生长动力学、死亡率和转移计数是最适合评估抗癌功效的参数。与传统化疗相比，光药物治疗中应用了一个额外的因素 – 光。因此，需要两个对照动物组：一个仅接收载体，另一个接收载体和辐射。这种设置可以评估光对测量参数的影响。在我们的实验中，两个实验组的动物接受非活化化合物，并对一组小鼠的肿瘤进行照射。对照组和治疗组的照射方案相同。在此阶段没有必要与基准化疗进行比较，因为实验的主要目的是证明光和复方应用的综合效果。然后可以选择表现出这种效果的最佳化合物来进一步研究它们的 体内 毒性，并与基准进行比较，以对其开发做出重要的不可行的决定。从技术上讲，我们描述的 体内 实验可以很容易地适应药代动力学或药效学研究，例如，已经选择作为药物先导物的化合物。
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者承认H2020-MSCA-RISE计划通过PELICO （#690973）和ALISE（#101007256）项目提供的欧盟资助。这项工作得到了DFG-GRK 2039（SA，TS和ASU），亥姆霍兹协会的NACIP计划（SA和ASU）以及BMBF（OB和ASU）的VIP+的支持。我们感谢卡尔斯鲁厄理工学院的Serhii Koniev博士，他合成了化合物LMB002，对其进行了纯化，并为该研究提供了化合物。作者还感谢在乌克兰拍摄和编译视频的Chupryna Maksym，以及所有勇敢的乌克兰捍卫者，他们使实验性工作，写作和拍摄该出版物成为可能。
Materials
| Agilent 1100 Series capillary LC system | ALSI-Chrom (Agilent distributor) | – | |
| ATCC CRL-1642, LL/2 (LLC1) Lewis lung carcinoma cell line | ECACC | 90020104 | |
| C57BL/6NCrl mice, female, inbred | Charles River | Strain code: 027 | |
| CelCulture, CO2 incubator | Esco Micro | CCL-170B | |
| Corning Matrigel Basement membrane matrix | Merck | CLS354234 | |
| Corning, 384- well spheroid microplates | Merck | CLS3830 | |
| Fetal bovine serum | Merck | F7524 | |
| Gibco, DPBS | Thermo Fisher Scientific | 21600044 | |
| Gramicidin S | Lumobiotics | Custom synthesis | |
| HyClone, DMEM/high glucose | Cytiva | SH30003.04 | |
| IN Cell Analyzer 6500HS, imaging system | Cytiva | 29240358 | |
| Invitrogen, Calcein AM | Thermo Fisher Scientific | C1430 | |
| Isoflurane anesthesia machine | ASA | S/N ASA 1305 | |
| L-glutamine, 200 mM solution | Merck | G7513 | |
| LIKA-surgeon, diode surgery laser | Fotonika plus | – | |
| LMB002 | Lumobiotics | Custom synthesis | |
| Penicillin–Streptomycin, solution stabilized | Merck | P4333 | |
| PhenoPlate, 96-well plates | PerkinElmer | 6055302 | |
| Photometer PCE-LED 20 | PCE Instruments | PCE-LED 20 | |
| Thermo Scientific, Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | 62249 | |
| Thermo Scientific, Propidium iodide | Thermo Fisher Scientific | J66764-MC | |
| Trypan blue, 0.4% solution | Merck | T8154 | |
| Trypsin–EDTA, 10 x solution | Merck | T4174 | |
| UltraCruz Cell culture flasks with vented caps, 75 cm2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-200263 | |
| UltraCruz, bottle top filters, PES, 0.22 μm | Santa Cruz Biotechnology | sc-360882 | |
| Vydac 218TP, C18 HPLC column (4.6 mm × 250 mm, 5 µm) | Altmann Analytik (Avantor distributor) | GR5103827 |
Riferimenti
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Citazione di questo articolo
Horbatok, K., Makhnii, T., Kosach, V., Danko, V., Kovalenko, A., Fatiushchenkov, S., Borysko, P., Pishel, I., Babii, O., Ulrich, A. S., Schober, T., Afonin, S., Komarov, I. V. In Vitro and In Vivo Evaluation of Photocontrolled Biologically Active Compounds – Potential Drug Candidates for Cancer Photopharmacology. J. Vis. Exp. (199), e64902, doi:10.3791/64902 (2023).