التقييم في المختبر وفي الجسم الحي للمركبات النشطة بيولوجيا التي يتم التحكم فيها ضوئيا - الأدوية المرشحة المحتملة للسرطان علم الأدوية الضوئية
Summary
يقدم هذا البروتوكول مجموعة من التجارب المعتمدة لتقييم الببتيدات المضادة للسرطان القابلة للتبديل الضوئي ، والتي يمكن استخدامها في الفحص قبل السريري لهذه المركبات. وهذا يشمل تقييم السمية الخلوية في مزارع الخلايا 2D و 3D ، وتقييم كفاءة الأيزوميرة الضوئية خارج الجسم الحي (الأنسجة النموذجية) ، وفعالية الجسم الحي .
Abstract
المركبات النشطة بيولوجيا التي يتم التحكم فيها ضوئيا هي فئة ناشئة من الأدوية “الذكية” المرشحة. أنها توفر أمانا إضافيا في العلاج الكيميائي الجهازي بسبب تنشيطها الزماني المكاني الدقيق عن طريق توجيه ضوء حميد غير مؤين إلى موقع معين داخل جسم المريض. تقدم هذه الورقة مجموعة من الطرق لتقييم الفعالية في المختبر والكفاءة خارج الجسم الحي للتنشيط الضوئي للمركبات النشطة بيولوجيا التي يتم التحكم فيها ضوئيا بالإضافة إلى الفعالية في الجسم الحي في المراحل المبكرة من تطوير الدواء. يتم تطبيق المنهجية على الببتيدات السامة للخلايا المضادة للسرطان ، وهي النظائر المحتوية على الدياريلثين لمضاد حيوي معروف ، gramicidin S. يتم إجراء التجارب باستخدام 2D (الخلايا الملتصقة) و 3D (كروية) مزارع الخلايا لخط الخلايا السرطانية (سرطان الرئة لويس ، LLC) ، بدائل الأنسجة الحية (لحم الخنزير المفروم) ، ونموذج سرطان الطعم الخيفي (تحت الجلد LLC) في الفئران ذات الكفاءة المناعية. يتم اختيار المركبات الأكثر فعالية وتقدير نوافذ العلاج الضوئي الواقعية عبر الفحص المجهري الفلوري الآلي. يتم تحديد كفاءة التنشيط الضوئي في أنظمة الإضاءة المختلفة على أعماق مختلفة في نسيج نموذجي ، ويتم تطبيق جرعة الضوء المثلى في التجربة العلاجية النهائية في الجسم الحي.
Introduction
ظهرت المركبات النشطة بيولوجيا التي يتم التحكم فيها ضوئيا في العقود الأخيرة كعنصر واعد في العلاجات الكيميائية الآمنة للأمراض البشرية وللقضاء على الأورام الصلبة الخبيثة على وجه التحديد1. تحتوي هذه المركبات على شظايا قابلة للإيزوميريز الضوئي عكسيا (مفاتيح ضوئية جزيئية) ويمكنها التبديل بين الأيزومرات الضوئية غير النشطة والنشطة عند التشعيع بضوء بأطوال موجية مختلفة.
بالمقارنة مع نظائرها التي لا يمكن التحكم فيها ضوئيا ، قد تكون الأدوية التي يتم التحكم فيها ضوئيا أكثر أمانا لأنه يمكن إدخالها بشكل منهجي في جسم المريض بأشكال أقل نشاطا وغير سامة بشكل أساسي ، ثم يتم تنشيطها بالضوء فقط عند الضرورة ، كما هو الحال في الأورام والقرح والجروح. على الرغم من أنه يمكن العثور على العديد من العروض المثيرة لمثل هذه النماذج الأولية للأدوية الجزيئية في الأوراق الأكاديمية الحديثة2،3،4،5،6،7 ، إلا أن مجال علم الأدوية الضوئية السريرية – وهو تطبيق لمجموعات الأدوية / الأجهزة الطبية / الأمراض المعتمدة – غير موجود. علم الأدوية الضوئية لا يزال في مرحلة اكتشاف الأدوية ، والدراسات قبل السريرية المنهجية غير معروفة.
لقد أظهرنا مؤخرا فقط ميزة السلامة في الجسم الحي لبعض الببتيدات المضادة للسرطان التي يتم التحكم فيها ضوئيا ، وهي نظائر المضاد الحيوي الببتيد gramicidin S8. تحتوي هذه المشتقات التي يتم التحكم فيها ضوئيا على مفتاح ضوئي diarylethene (DAE) ، والذي يخضع لتحولات ضوئية عكسية بين ما يسمى بالأشكال الضوئية “المفتوحة الحلقة” الناتجة عن الضوء الأحمر والأشكال الضوئية “المغلقة الحلقة” الناتجة عن الأشعة فوق البنفسجية (الموضحة في الشكل 1 لأحد المشتقات ، المركب LMB002).
الشكل 1: الببتيد السام للخلايا المتحكم فيه ضوئيا LMB002 وإيزوميره الضوئي. تظهر قطعة اليوميات باللون الأحمر. اختصار: DAE = diarylethene. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
غالبا ما يتطلب العثور على النتائج وإجراء التحسين من الضرب إلى الرصاص فحصا في المختبر وفي الجسم الحي للمكتبات المركبة المناسبة 9,10. هنا ، نوضح منهجية مناسبة للفحص المنهجي عالي الإنتاجية للسمية الخلوية للمركبات التي يتم التحكم فيها ضوئيا. نحدد أيضا كفاءة الأيزوميرة الضوئية ، ونقدر جرعة الضوء في الأنسجة النموذجية ، ونقيم الفعالية في الجسم الحي للمرشحين الأفضل أداء. ويتوافق هذا النهج مع اعتبارات أخلاقيات البيولوجيا ورعاية الحيوان.
في هذا العمل ، يتم تعديل الطرق التقليدية قبل السريرية لتجنب الأيزوميرة الضوئية غير المنضبطة للمركبات المختبرة. الهدف العام من تطبيق هذه الأساليب المعدلة هنا هو تطوير استراتيجية عامة مباشرة وسريعة وتنتج بيانات ذات دلالة إحصائية لمقارنة الأنشطة في المختبر بشكل موثوق وترشيد اختبار الفعالية في الجسم الحي للمركبات القابلة للتبديل الضوئي لتحديد الرصاص ومواصلة التطوير.
تتكون الاستراتيجية من ثلاث خطوات متتالية. تتضمن الخطوة الأولى تحديد IC 50 (صلاحية الخلية الظاهرة بنسبة50 ٪) في التخفيفات التسلسلية للأشكال الضوئية النشطة وغير النشطة لمركبات نشطة بيولوجيا يتم التحكم فيها ضوئيا باستخدام ثقافات خلايا ثنائية الأبعاد (2D ، أحادية الطبقة) وثلاثية الأبعاد (3D ، كروية) والمجهر الفلوري الآلي عالي الإنتاجية متحد البؤر. تتم مقارنة نوافذ العلاج الضوئي فيما يتعلق بفرق IC50 بين الشكلين الضوئيين ، ويتم اختيار المرشحين الأفضل أداء. لا توجد ميزة محددة في تقييم السمية بواسطة الفحص المجهري الآلي ومنصات فحص السمية الخلوية الأخرى (المقايسات)11 ؛ يمكن تنفيذ نماذج الورم القائمة على الخلاياالأكثر تعقيدا 12 بسهولة في هذه المرحلة.
بالنسبة للمركبات المختارة في الخطوة 1 ، فإن الخطوة الثانية هي تقدير كفاءة التبديل الضوئي داخل الأنسجة بشكل واقعي كدالة للعمق من سطح الأنسجة المشع عن طريق تحديد كفاءة التبديل الضوئي للأشكال الضوئية الأقل نشاطا في بديل الأنسجة باستخدام كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء مكتشفة بالأشعة فوق البنفسجية (HPLC) لمستخلصات العينات المشععة. في الجسم الحي ، يمكن دراسة كفاءة التبديل الضوئي ، لكننا نقترح استخدام بديل بسيط للأنسجة – لحم الخنزير المفروم. لقد اختبرنا صحة هذا النهج. قمنا بقياس تحويل مركباتنا القابلة للتبديل الضوئي في الجسم الحي على نموذج سرطان الفئران ولاحظنا نفس التحويل الضوئي تقريبا على عمق تم قياسه في التجارب السابقة مع الفئران8. يمكن استخدام أي نسيج اصطناعي بديل مناسب13 أو 3D نسيج / عضو مطبوع بيولوجيا14 أو مواد خزعة أو مادة حيوانية أخرى معفاة. ومع ذلك ، فإن هذا الإعداد هو حل وسط جيد لأنه اقتصادي وسريع وأخلاقي.
الخطوة الثالثة هي تحديد فعالية مضاد للسرطان في الجسم الحي في نموذج سرطان الفئران. تم اختيار المركبات التي تظهر خصائص متفوقة في التجارب في المختبر والتبديل الضوئي بكفاءة على عمق لا يقل عن 1-1.5 سم في أنسجة النموذج لهذه التجربة.
يمكن تطبيق هذا البروتوكول على المركبات التي تمتلك أنواعا مختلفة من المفاتيح الضوئية ، بشرط أن تكون أشكالها الضوئية (أو حالاتها الضوئية الثابتة ، PSS) مستقرة لفترة معقولة (بضعة أيام أو أكثر). للتوضيح ، يتم استخدام LMB002 المشتق من DAE الموصوف سابقا15. الأشكال الضوئية LMB002 مستقرة حراريا ويمكن تخزينها عند -20 درجة مئوية لمدة عام على الأقل دون تدهور كبير. يتم اختيار خلايا سرطان الرئة لويس (LLC) لهذا في المختبر وفي الجسم الحي ، ولكن لا يتم فرض قيود على نوع الخلية. خلايا LLC ملتصقة ، قابلة للزراعة بسهولة في 3D ، وتستخدم لتوليد الأورام (كما هو موضح في المرجع16). في الجسم الحي تستخدم خلايا LLC لنمذجة العمليات النقيلية ويمكن أن تولد بسهولة أوراما صلبة في الفئران ذات الكفاءة المناعية بعد الحقن تحت الجلد. يمكن تطبيق هذه المنهجية في الجسم الحي عالميا على نماذج السرطان الأخرى17,18. ويرد أدناه وصف تفصيلي للتنفيذ التفصيلي لهذه الاستراتيجية.
Protocol
Representative Results
Discussion
المركبات التي يتم التحكم فيها ضوئيا لم يسبق لها مثيل في تطوير الأدوية. ومع ذلك ، لم يتم إنشاء طرق لتقييمهم قبل السريري والسريري. أقرب علاج وحيد تناظري ، العلاج الضوئي الديناميكي (PDT) ، هو طريقة العلاج للاستخدام السريري التي اعتمدتها العديد من البلدان ضد السرطان وهو قيد التطوير لمؤشرات أخرى19,20. على غرار علم الأدوية الضوئية ، يعتمد PDT أيضا على استخدام الضوء لتنشيط المادة النشطة بيولوجيا (الأكسجين المفرد). لذلك ، يمكن اعتماد بعض الطرق التجريبية المستخدمة للدراسات قبل السريرية والسريرية في PDT لعلم الأدوية الضوئية. على سبيل المثال ، مصادر الضوء ، ونهج توصيل الضوء ، والأجهزة الطبية متطورة بشكل جيد ومعتمدة ل PDT ؛ يمكن استخدامها مباشرة لتقييم الأدوية الخاضعة للرقابة الضوئية. ومع ذلك ، فإن PDT وعلم الأدوية الضوئية لهما العديد من الفروق عن بعضهما البعض4 ، مما يبرر الحاجة إلى إنشاء طرق محددة لهذا الأخير.
أولا ، المادة غير المنشطة في PDT (الأكسجين) موجودة دائما في الأنسجة الحية بتركيزات غير سامة. على النقيض من ذلك ، يمكن أن يكون للمركبات النشطة بيولوجيا غير النشطة التي يتم التحكم فيها ضوئيا نشاط متبقي وسمية غير مرغوب فيها. لذلك ، يجب أن تقلل الأدوية الضوئية المثالية من النشاط البيولوجي في شكلها المدار ويجب أن تكون نشطة للغاية في شكلها المولد بالضوء ، ويجب أن تكون “نافذة العلاج الضوئي“21 كبيرة قدر الإمكان. يتطلب العثور على الضربة والأداء الأمثل من الضرب إلى الرصاص تحديد المركبات المناسبة وفحص المكتبات الكبيرة نسبيا ، التي كانت بالفعل في المراحل المبكرة من تطوير الأدوية. هنا ، اقترحنا مجهرا فلوريا آليا عالي الإنتاجية لتحديد مركبات التبديل الضوئي الفعالة.
تسمح الطريقة المختارة لتقييم السمية الخلوية بالتنفيذ السهل للمتطلبات الأكثر أهمية – صيانة PSS أو استقرار الأيزومر الضوئي المرئي الحساس للضوء. هذا لأنه ، عند تنفيذه ، يتم تقليل التعرض للضوء. ومن ثم ، في حالة اختيار طرق بديلة ، يجب تفضيل الطرق الآلية. هذا النهج موثوق وغني بالمعلومات. يوفر استخدام ثقافات الخلايا 3D (كروية) في هذه المرحلة فهما شاملا لاستجابة الخلية للعلاج في بيئة دقيقة أكثر واقعية تشبه الأنسجة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن الحصول على رؤى قيمة حول آلية عمل المركبات باستخدام الفحص المجهري كطريقة مباشرة. يسمح المجهر الفلوري متحد البؤر مع بروتوكول التلوين المناسب بالتقييم البصري لمورفولوجيا الخلايا والأجسام الكروية. يمكن أيضا اكتشاف تفاصيل مهمة عن موت الخلية والتغيرات داخل الخلايا.
ثانيا ، يتطلب التطبيق الخفيف اختيارا دقيقا لجرعة الضوء. في PDT ، جرعة زائدة من الضوء ضارة للغاية للأنسجة22. يمكن أن يكون العلاج الدوائي الضوئي مفيدا في ظل التشعيع الضوئي المفرط. يتم تحديد الحد الأعلى للمادة المنشطة من خلال الجرعة المعطاة للمادة غير المنشطة وحركيتها الدوائية. ومع ذلك ، لا تزال الجرعة الخفيفة مشكلة في علم الأدوية الضوئية. يجب توخي الحذر لضمان أن كثافة طاقة التشعيع ووقت التعرض لا تقل عن متطلبات العلاج. من حيث المبدأ ، يمكن مراقبة توليد المادة المنشطة في الجسم الحي. ومع ذلك ، لأسباب تتعلق بأخلاقيات البيولوجيا ، اقترحنا تجربة مع نسيج نموذجي (لحم مفروم طازج) ممزوج بالمركب غير المنشط15. هذه التجربة بسيطة ويمكن تعديلها لاستخدام مصادر ضوء مختلفة. يمكن أيضا تكييفه للتقدير الضوئي الفيزيائي لجرعة الضوء وقياس التأثيرات الحرارية. هنا مرة أخرى ، باستخدام الأنسجة النموذجية ، من الممكن تقليل التعرض للضوء ، مقارنة ، على سبيل المثال ، بتحديد كفاءة التبديل الضوئي الأكثر دقة في ظروف الجسم الحي ، وهو بديل قد يكون من المثير للاهتمام دائما النظر فيه.
أخيرا ، يمكن اختيار المركبات التي تظهر خصائص متفوقة في شاشات السمية في المختبر والتبديل الضوئي بكفاءة على عمق 1-1.5 سم على الأقل في أنسجة النموذج لإجراء دراسات مكلفة وشاقة وطويلة في الجسم الحي . في هذا البروتوكول ، استخدمنا نفس خط الخلية (LLC) كما في التقييم في المختبر لإنشاء نموذج سرطان الطعم الخيفي. ديناميكيات نمو الورم ، والوفيات ، وعدد النقائل هي المعلمات الأكثر ملاءمة لتقييم فعالية مضاد السرطان. بالمقارنة مع العلاج الكيميائي التقليدي ، يتم تطبيق عامل إضافي في العلاج الضوئي – الضوء. لذلك ، هناك حاجة إلى مجموعتين من التحكم: واحدة تستقبل السيارة فقط والأخرى التي تستقبل السيارة والتشعيع. يتيح هذا الإعداد تقييم تأثير الضوء على المعلمات المقاسة. في تجربتنا ، تلقت المجموعتين التجريبيتين المركب غير المنشط ، وتم تشعيع أورام الفئران في مجموعة واحدة. كان نظام التشعيع متطابقا بالنسبة لمجموعات المراقبة والعلاج. المقارنة مع العلاج الكيميائي القياسي ليست ضرورية في هذه المرحلة لأن الغرض الرئيسي من التجربة هو إظهار التأثير المشترك للتطبيق الخفيف والمركب. يمكن بعد ذلك اختيار المركبات الأفضل أداء التي تظهر هذا التأثير لمزيد من الدراسة حول سميتها في الجسم الحي ومقارنتها بالمعايير لاتخاذ قرارات مهمة بشأن تطورها. من الناحية الفنية ، يمكن تكييف التجربة في الجسم الحي التي نصفها بسهولة مع دراسات الحرائك الدوائية أو الديناميكا الدوائية ، على سبيل المثال ، لمركب تم اختياره بالفعل كرصاص دوائي.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يقر المؤلفون بتمويل الاتحاد الأوروبي من خلال برنامج H2020-MSCA-RISE من خلال مشاريع PELICO (# 690973) و ALISE (# 101007256). تم دعم هذا العمل من قبل DFG-GRK 2039 (SA و TS و ASU) ، وبرنامج NACIP التابع لجمعية هيلمهولتز (SA و ASU) ، و VIP + من BMBF (OB و ASU). نعترف بالدكتور سيرهي كونييف ، معهد كارلسروه للتكنولوجيا ، الذي قام بتصنيع مركب LMB002 ، وتنقيته وقدم المركب للدراسة. كما يشكر المؤلفون تشوبرينا ماكسيم التي صورت وجمعت الفيديو في أوكرانيا ، ولجميع المدافعين الشجعان عن أوكرانيا الذين جعلوا العمل التجريبي والكتابة والتصوير هذا المنشور ممكنا.
Materials
| Agilent 1100 Series capillary LC system | ALSI-Chrom (Agilent distributor) | – | |
| ATCC CRL-1642, LL/2 (LLC1) Lewis lung carcinoma cell line | ECACC | 90020104 | |
| C57BL/6NCrl mice, female, inbred | Charles River | Strain code: 027 | |
| CelCulture, CO2 incubator | Esco Micro | CCL-170B | |
| Corning Matrigel Basement membrane matrix | Merck | CLS354234 | |
| Corning, 384- well spheroid microplates | Merck | CLS3830 | |
| Fetal bovine serum | Merck | F7524 | |
| Gibco, DPBS | Thermo Fisher Scientific | 21600044 | |
| Gramicidin S | Lumobiotics | Custom synthesis | |
| HyClone, DMEM/high glucose | Cytiva | SH30003.04 | |
| IN Cell Analyzer 6500HS, imaging system | Cytiva | 29240358 | |
| Invitrogen, Calcein AM | Thermo Fisher Scientific | C1430 | |
| Isoflurane anesthesia machine | ASA | S/N ASA 1305 | |
| L-glutamine, 200 mM solution | Merck | G7513 | |
| LIKA-surgeon, diode surgery laser | Fotonika plus | – | |
| LMB002 | Lumobiotics | Custom synthesis | |
| Penicillin–Streptomycin, solution stabilized | Merck | P4333 | |
| PhenoPlate, 96-well plates | PerkinElmer | 6055302 | |
| Photometer PCE-LED 20 | PCE Instruments | PCE-LED 20 | |
| Thermo Scientific, Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | 62249 | |
| Thermo Scientific, Propidium iodide | Thermo Fisher Scientific | J66764-MC | |
| Trypan blue, 0.4% solution | Merck | T8154 | |
| Trypsin–EDTA, 10 x solution | Merck | T4174 | |
| UltraCruz Cell culture flasks with vented caps, 75 cm2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-200263 | |
| UltraCruz, bottle top filters, PES, 0.22 μm | Santa Cruz Biotechnology | sc-360882 | |
| Vydac 218TP, C18 HPLC column (4.6 mm × 250 mm, 5 µm) | Altmann Analytik (Avantor distributor) | GR5103827 |
Riferimenti
- Fuchter, M. J. On the promise of photopharmacology using photoswitches: a medicinal chemist’s perspective. Journal of Medicinal Chemistry. 63 (20), 11436-11447 (2020).
- Volarić, J., Szymanski, W., Simeth, N. A., Feringa, B. L. Molecular photoswitches in aqueous environments. Chemical Society Reviews. 50, 12377-12449 (2021).
- Paoletti, P., Ellis-Davies, G. C. R., Mourot, A. Optical control of neuronal ion channels and receptors. Nature Reviews Neuroscience. 20, 514-532 (2019).
- Hüll, K., Morstein, J., Trauner, D. In Vivo Photopharmacology. Chemical Reviews. 118 (21), 10710-10747 (2018).
- Ma, X., et al. In vivo photopharmacology with a caged mu opioid receptor agonist drives rapid changes in behavior. Nature Methods. 20, 682-685 (2023).
- Sarabando, S. N., Palmeira, A., Sousa, M. E., Faustino, M. A. F., Monteiro, C. J. P. Photomodulation Approaches to Overcome Antimicrobial Resistance. Pharmaceuticals. 16 (5), 682 (2023).
- Kolarski, D., Szymanski, W., Feringa, B. L., Hirota, T., Hatori, M., Panda, S. Chronophotopharmacology: Methodology for high spatiotemporal control over the circadian rhythm with light. Neuromethods. 186, (2022).
- Babii, O., et al. Peptide drugs for photopharmacology: how much of a safety advantage can be gained by photocontrol. Future Drug Discovery. 2 (1), FDD28 (2020).
- Davis, A. M., Keeling, D. J., Steele, J., Tomkinson, N. P., Tinker, A. C. Components of successful lead generation. Current Topics in Medicinal Chemistry. 5 (4), 421-439 (2005).
- Balani, S. K., Miwa, G. T., Gan, L., Wu, J., Lee, F. W. Strategy of utilizing in vitro and in vivo adme tools for lead optimization and drug candidate selection. Current Topics in Medicinal Chemistry. 5 (11), 1033-1038 (2005).
- Kleijn, A., et al. A Systematic comparison identifies an ATP-based viability assay as most suitable read-out for drug screening in glioma stem-like cells. Stem Cells International. 2016, (2016).
- Rodrigues, J., Heinrich, M. A., Teixeira, L. M., Prakash, J. 3D in vitro model revolution: unveiling tumor-stroma interactions. Trends in Cancer. 7 (3), 249-264 (2021).
- Sittinger, M., et al. Tissue engineering and autologous transplant formation: practical approaches with resorbable biomaterials and new cell culture techniques. Biomaterials. 17 (3), 237-242 (1996).
- Matai, I., Kaur, G., Seyedsalehi, A., McClinton, A., Laurencin, C. T. Progress in 3D bioprinting technology for tissue/organ regenerative engineering. Biomaterials. 226, 119536 (2020).
- Babii, O., et al. Direct photocontrol of peptidomimetics: an alternative to oxygen-dependent photodynamic cancer therapy. Angewandte Chemie International Edition. 55 (18), 5493-5496 (2016).
- De Ridder, K., et al. Novel 3D lung tumor spheroids for oncoimmunological assays. Advanced NanoBiomed Research. 2 (4), 2100124 (2022).
- Pauli, C., et al. Personalized in vitro and in vivo cancer models to guide precision medicine. Cancer Discovery. 7 (5), 462-477 (2017).
- Van Straten, D., Mashayekhi, V., De Bruijn, H. S., Oliveira, S., Robinson, D. J. Oncologic photodynamic therapy: basic principles, current clinical status and future directions. Cancers. 9 (2), 19 (2017).
- Li, X., Kwon, N., Guo, T., Liu, Z., Yoon, J. Innovative strategies for hypoxic-tumor photodynamic therapy. Angewandte Chemie International Edition. 57 (36), 11522-11531 (2018).
- Hull, K., Morstein, J., Trauner, D. In vivo photopharmacology. Chemical Reviews. 118 (21), 10710-10747 (2018).
- Babii, O., et al. Structure-activity relationships of photoswitchable diarylethene-based β-hairpin peptides as membranolytic antimicrobial and anticancer agents. Journal of Medicinal Chemistry. 61 (23), 10793-10813 (2018).
- Heckl, C., Aumiller, M., Rühm, A., Sroka, R., Stepp, H. Fluorescence and treatment light monitoring for interstitial photodynamic therapy. Photochemistry and Photobiology. 96 (2), 388-396 (2020).
