無傷の心臓小柱を用いたリラクゼーションの機械的制御

以下のプロトコルは、ウェイン州立大学の施設動物管理および使用委員会によって承認されています。ここでのプロトコルは、げっ歯類の実験対象を利用するためのステップを記載しているが、他のモデル生物における使用に適合させることができる。 1. 事前準備 実験対象を入手し、実験室に順応させます。 pH 7.3で、それぞれ10〜20 ppmのO2に酸素化することにより、250 mLの灌流溶液と250 mLの修飾タイロード溶液(表1)を準備します。 カニューレを取り付けた5mLシリンジを準備します。シリンジに灌流液を入れます。マウスには23 G、小型または大型のラットにはそれぞれ18または16 Gのカニューレを使用します。鈍い針の端に長さ1mmのポリエチレン(PE)チューブをスライドさせて(材料表)、結ばれた後に大動脈がカニューレから滑り落ちるのを防ぎます。 解剖およびカニュレーション領域の完全な準備(図1)2つのきれいな計量ボートの少なくとも半分に灌流溶液を入れます。カニューレの先端を灌流溶液に浸し、カニューレの周りに少なくとも1つの二重ループ縫合糸を配置します。バークランプでシリンジを所定の位置に保持します。 簡単にアクセスできるように、外科用はさみ、止血剤、虹彩鉗子、小さな湾曲したはさみ、および2つの#3鉗子を配置します。 改変されたTyrodeの溶液をプライミングして実験システム全体に循環させることにより、実験システム(図2)を準備します。チャンバーが完全にいっぱいで安定していることを確認してください。 力変換器、長さモーター、ペーシングシステム、温度制御システム、データ収集コンピューターなど、すべてのデータ取得ボックスの電源を入れます。 現在の実験を参照するために必要な *.dap ファイルとポインター ファイルを含むテンプレート フォルダーをコピーして名前を変更します。データ集録ソフトウェアを開きます。 超純水または灌流溶液中の10%(w/v)ウシ血清アルブミン(BSA)に先端を沈めて、小柱分離ツール(バンナスハサミ、#5または#55鉗子、ガラスプローブ)を準備し、金属をタンパク質でコーティングします(図2B)。注:解剖前に実験システム全体を準備する必要があります。 2.肉眼的解剖およびカニューレ挿入 動物の被験者の識別、体重、およびその他の関連情報を記録します。 オプションで、冠状動脈灌流前の凝固のリスクを最小限に抑えるために、安楽死の少なくとも10分前に腹腔内注射 を介して 齧歯類に滅菌生理食塩水中の1,000 U / kgヘパリンを注射します。. 動物を誘導室に入れ、標準的な手順に従って、100%酸素中で気化した3%〜5%イソフルランを使用して全身麻酔を誘発する。注意: イソフルランへの暴露を最小限に抑えるために使用される外部スカベンジャー、ダウンドラフトテーブル、またはヒュームフードをオンにします。 げっ歯類が右反射を失い、呼吸数が遅くなったら:(ラットの場合)動物を誘導室から取り出し、ノーズコーンを通して麻酔を続けながら、解剖パッドに仰臥位で置きます。 (マウスの場合)誘導室から動物を取り出した直後に頸部脱臼を行う。ノーズコーンは必要ありません。イソフルラン気化器を0%にします。 必要に応じて、げっ歯類の上肢を胸壁から離れた解剖パッドに貼り付け、ピンで支えられたテープを使用して、動物に突き刺さらないように注意します。解剖に進む前に、適切な麻酔の深さ(つま先のつまみ反応の欠如)を確認してください。 剣状突起のすぐ下で外科用ハサミ(ラットの場合はメイヨー、マウスの場合はメッツェンバウム)を使用して、げっ歯類の腹部の全幅を横切って腹膜腔に皮膚を横切って切断します。 外科用ハサミを使用して、横方向の切り傷から胸壁の左側と右側の両方に2つの垂直切り込みを傍矢状(胸壁の側面の上)にします。次に、横隔膜を横切って切断し、傍矢状切断を接続し、胸腔を解放します。 止血剤を使用して剣状突起をげっ歯類の頭に向かってクランプして持ち上げ、胸骨と胸壁をげっ歯類の頭に向かって動かし、胸腔と心臓を露出させます。必要に応じて、傍矢状切開を第2椎骨腔の近くまですばやく伸ばして、心臓を完全に露出させたり、心膜を破壊したりします。 湾曲した虹彩鉗子を使用して、心臓を慎重に持ち上げて大きな血管を視覚化します。心筋とげっ歯類の脊椎の間に鉗子を置き、より大きな血管を締め付け、心房や心室部分を固定しないように注意しながら心臓を持ち上げます。心臓を少し持ち上げながら、湾曲した虹彩鉗子とげっ歯類の背骨の間に湾曲した虹彩はさみ(凹面)をすばやく置き、大きな血管と肺を心臓から切り取ります。心臓を新鮮な灌流液が入った計量ボートまたはビーカーにすばやく移動し、振って心臓から血液を取り除きます。 イソフルラン気化器を0%にします(まだ行っていない場合)。肺、心膜、またはその他の組織の大部分が心臓に付着したままの場合は、カニューレ挿入への干渉を最小限に抑えるために、この時点でそれらを慎重に切り取って廃棄してください。 湾曲した虹彩鉗子を使用して、準備したカニューレを水没させた状態で、心臓をきれいな計量ボートまたはビーカーに移動します。大動脈をカニューレし、ループ状の絹縫合糸を締めて大動脈を固定し、最大5 mLの灌流溶液で洗い流します。 カニューレから心臓を取り出し、シリコーンエラストマーでコーティングされた計量皿に入れて、小柱の分離の準備をします。 3.小柱の分離と平衡化 実体顕微鏡下でシリコーンエラストマーコーティングされた皿に心臓を置き、それを照らします。 右心室流出路を見つけます。左心房と心室の頂点を皿のシリコーンエラストマーに固定します。 長いバンナはさみを使用して、右心室流出路から中隔に沿って頂点まで切り取ります。右心室流出路から大動脈近くの右心房まで切断し、次に右心房を切断します(図3B)。 鉗子を使用して、組織を伸ばさないように注意しながら、流出管から右心室(RV)のない壁を慎重に引き開きます。注:実験者は、心配することなく切断できる細い白い結合組織ストランドを見つける場合があります。より大きなピンク色(組織)色のストランドは、分離できる小柱である可能性があるため、注意して評価する必要があります。 右心室三角形の自由壁を皿に固定し、右心室を露出させる(図3C)。 溶融し、薄い(直径<500 μm)が鋭くない端部で形成されたガラスピペットを使用して、露出した心内膜で自立した小柱を検索します(図3C)。注:自立型小柱は、その下を完全に調べることができる筋肉のストリップです。三角形の乳頭筋を避けて、平行な辺(一定の幅)を持つ小柱を使用してください。このプロセスとその後の解剖中は、小柱にひずみを加えると損傷を引き起こし、発生した力が低下する可能性があるため、注意してください。 小さなバンナハサミを使用して小柱を解剖します。小柱の両端に≥1 mmの立方体の組織片を残して、取り付けを可能にします。可能な限り小柱を伸ばさず、金属製の工具も筋肉に損傷を与える可能性があるため、接触を最小限に抑えてください。特定された小柱の近くの筋肉への負担を最小限に抑えるために、必要に応じて心臓を保持しているピンを再配置します。 7 mLトランスファーピペットの端から~2インチを切り取り、小柱をゆっくりとピペットに引き込み、50%灌流溶液と50%修飾Tyrode溶液を含む新しい計量皿に移します。筋肉を混合溶液中の細胞外カルシウムの増加に数分間平衡化させます。ステップ3.7〜3.8を繰り返して、この時点で追加の小柱を解剖し、バックアップとして追加の小柱を取得します。 実験チャンバーに過融合および/または吸引を供給するポンプをオフにします。大口径トランスファーピペットを使用して、Tyrodeの溶液で満たされた実験チャンバーに小柱を移動します。 小柱の端にある1つの>1 mmの立方体の組織片を力変換器のフックに固定し、次に2番目の立方体をモーターに固定します。注意: トランスデューサーへのアクセスを改善するために最初の側面を取り付けるときはモーターと力のトランスデューサーを分離し、小柱がたるんだまま2番目の立方体の組織を取り付けるときはフックをできるだけ近づけます。 灌流を再開し、筋肉のペーシングを開始してしきい値電圧を決定します。閾値電圧を20%上回るペースで約1時間、小柱を平衡化させます。 この平衡期間の終わりに、発達した(最小からピークまでの)張力を観察することにより、最適な発達応力発生が達成されるまで、モーターに接続されたマイクロメーターを使用して筋肉をゆっくりと伸ばします。受動的な拡張期緊張がピーク張力よりも速く上昇し、最適な長さが経過したことを示す場合は、筋肉の長さの増加を停止します。 透過顕微鏡照明をオフにし、グースネック照明器を使用して小柱を急角度で照らします。以前に較正された顕微鏡光学系を介して接続されたカメラを使用して、拡張期中の小柱の画像を実験フォルダにキャプチャします。小柱がカメラの視野よりも広い場合は、筋肉全体で複数の画像を撮ります。 ピクセル距離を報告するイメージングソフトウェアで画像を開きます。筋肉の直径のピクセル距離をその長さに沿って4回測定します。組織の大きな立方体を除いて、筋肉(小柱)の長さをピクセル単位で測定します。 筋肉の長さが視野よりも長い場合は、筋肉に沿って基準点を使用して全長を測定します。 実験フォルダ内のテンプレートを使用して、直径測定値を平均し、以前に取得したキャリブレーションを使用して直径と長さをピクセルからmmに変換します。断面積をπ*直径2/4(mm2)、筋肉の長さをμmで計算します。 4. データ取得 筋肉が平衡化されたら、データ収集ソフトウェアを開き、 実験を選択します|長さコントロールをクリックし、キャリブレーションされた小柱の長さ(FL)と断面積(面積[m2])をキャリブレーションボックスに入力します。 テンプレート フォルダー (手順 1.7) から、freeform_file.txtが正しいフォルダーを指していることを確認し、テキスト エディターで freeform.dap ファイルを開きます。*.dap ファイルで等張レベル (アイソトン) を 32,000 に設定します。 [長さコントロール]ボックスで、[フリーフォーム]タブを選択し、適切な フリーフォーム リストファイルを参照します。データファイリングパスが、データを保存するための正しいフォルダでもあることを確認してください。 Run Experimentを押して完全等尺性けいれんからのデータ集録を開始し、比例ゲインパラメータと積分ゲインパラメータを持つフィードバック制御を使用してロードクランプデータを集録します。 *.dapファイルでアフターロード(アイソトン)を定義して負荷クランプデータを集録し、テキストエディタでファイルを保存して比例ゲイン(propgain)パラメータと積分(Ki)パラメータの値を反復処理します。データ集録ソフトウェア・インターフェースの [実験の実行 ]を押します。モード(flswitch)を1から設定し、負荷クランプを終了するためのしきい値(flthreshold)をゼロから増やすことにより、この反復中にクランプが元の長さに再延長(緩和荷重5と呼ばれることもあります)してひずみ速度の最大範囲を達成することを確認します。 モード(flswitch)を1から0に変更して、負荷クランプの端を制御します。ロードクランプの終端をゼロ再延長から完全な再延長を開始長さに戻すように変更しながら、収集を繰り返します。長さを長くするには、筋肉がほぼ元の長さに戻るまで、負荷クランプ(flthreshold)を終了するためのしきい値をゼロから段階的に増やします。 モード(flswitch = 1)とスレッショルド(flthreshold = 0)をリセットし、最後のデータ集録を実行します。 必要に応じて、手順4.4〜4.6を繰り返してスタディのアフターロードを変更します。この取得はすぐに行うことができます。 必要に応じて、筋肉を伸ばしたり短くしたりして予圧を変更するか、Tyrodeの溶液に化合物を追加して筋肉を治療します。予圧を変更したり、コンパウンドを追加したりする場合は、低速応答20が安定していること、および/またはコンパウンドが筋肉に完全に浸透することを確認するには、最低9,15分待ちます。 データ取得が完了したら、小柱を取り除きます。必要に応じて、生化学的または組織学的分析のために小柱を凍結または固定します。 作業エリアと実験システムを清掃し、すべてのチューブを水で洗い流し、すべてのコンポーネントの電源を切ります。 5.データ分析 定量分析プログラムを使用して、適切なファイル・パスにプログラムを指定してデータ・ファイルを開きます。 データ解析プログラムがクランプされたビートを分析し、プログラムがロードクランプの開始を正しく取得するようにすることで、緩和を定量化します。等尺性緩和中の応力のピーク負の導関数から緩和率(1/τ)が定量化されるように、荷重クランプの端が特定されていることを確認します。 グランツ法16を使用して、この指数時定数、またはその他の緩和の適切な定量化(応力の最小導関数、ロジスティック時定数17、または運動学的モデル18)を決定します。 データ分析プログラムがひずみの時間微分を使用してひずみ速度を計算することを確認します。ひずみは、最適な収縮時の長さで割った時間の関数として長さとして計算されます。 特定の条件のすべてのトレースに対して上記の手順を繰り返します。 緩和速度とひずみ速度の関係をプロットし、最大データを1s-1未満の生理的ひずみ速度に制限します。緩和段階は指数関数的減衰を反映しない可能性があるため、低ひずみ速度(図4C)でのデータを除外します17,18。 緩和速度とひずみ速度の間の線の傾きを求め、その傾きをMCRの指標として記録します。 調査した条件ごとに上記の分析を繰り返します。