En klar til bruk frossen bestand av nevroner er et kraftig verktøy for å evaluere synaptiske funksjoner. Her introduserer vi en enkel primærkultur med lav tetthet fra frossen bestand ved hjelp av en 96-brønnsplate.
Neuronal kultur er et verdifullt system for evaluering av synaptiske funksjoner og legemiddelundersøkelser. Spesielt tillater en lavtetthetskultur av primære hippocampus-nevroner studiet av individuelle nevroner eller subcellulære komponenter. Vi har vist subcellulær proteinlokalisering i et nevron ved immunocytokjemi, nevronpolaritet, synaptisk morfologi og dens utviklingsendring ved bruk av en primær hippocampuskultur med lav tetthet. Nylig har klare frosne lagre av nevroner blitt kommersielt tilgjengelige. Disse frosne bestandene av nevroner reduserer tiden som trengs for å forberede dyreforsøk og bidrar også til reduksjon av antall dyr som brukes. Her introduserer vi en reproduserbar primærkulturmetode med lav tetthet ved bruk av en 96-brønnsplate. Vi brukte en kommersielt tilgjengelig frossen bestand av nevroner fra rotteembryonale hippocampus. Nevronene kan dyrkes stabilt på lang sikt uten medieendringer ved å redusere veksten av gliaceller på bestemte tidspunkter. Denne analysen med høy gjennomstrømning ved bruk av kultur med lav tetthet tillater reproduserbare bildebaserte evalueringer av synaptisk plastisitet.
Utviklingen av et in vitro eksperimentelt system som kan vurdere synaptiske funksjoner involvert i læring og hukommelse er viktig. Neuronal kultur er et verdifullt system for evaluering av synaptiske funksjoner in vitro. Den neuronale kulturteknikken ble først brukt på 1980-tallet, og på 1990-tallet ble lavdensitetskultur av primære hippocampus-nevroner utviklet 1,2,3 for studiet av individuelle nevroner når det gjelder subcellulær lokalisering av proteinkomponenter, proteinhandel, nevronpolaritet, ryggradsmorfologi, synapseutvikling og plastisitet 4,5,6,7,8 . Imidlertid er det mange trinn involvert i denne teknikken: parring av dyr, dissekering av embryoer, forberedelse av kulturbeholdere og dyrking av celler i 3 uker med medieendringer en gang i uken. I tillegg krever det forhåndsteknikker3.
Vi har utviklet frosne bestander av dissosierte hippocampus-nevroner fra rotteembryoer 9,10. De frosne lagrene av nevroner er klare til bruk, og det kreves ingen forhåndsteknikker for å dyrke cellene11,12. Med andre ord, dyrking av nevronene fra frosne bestander er ikke avhengig av teknikken til en eksperimentator. Det eliminerer behovet for dyreforsøk (f.eks. tillatelse til dyreforsøk, arrangering av tidsbestemte drektige dyr og dissekering av rotteembryoer), og reduserer dermed antall dyr som brukes. Nylig har frosne lagre av nevroner av høy kvalitet blitt kommersielt tilgjengelige. Her brukte vi kommersielt tilgjengelige frosne bestander fra embryonale dag (E) 18 rotte hippocampus13,14,15. Dyrking av nevronene fra en frossen bestand krever ikke gliabetingede medier eller samkultur med gliaceller. Vanlige primærkulturmedier uten ekstra serum kan brukes til å dyrke cellene; Derfor kan vi skaffe reproduserbare data. Videre er det ikke behov for medieutveksling i 3 uker etter cellesåingen, da veksten av gliaceller er redusert (figur 1).
Dendritiske pigger er det postsynaptiske rommet til de fleste eksitatoriske synapser. De inneholder reseptorproteiner, postsynaptiske stillasproteiner og aktincytoskeletale proteiner. Vi fokuserte på et aktinbindende protein drebrin 5,6,7,16,17,18. Drebrin akkumuleres ved ryggradshodet i modne nevroner19, og vi rapporterte drebrin som markør for synaptisk tilstand 15,17,20,21,22,23. Ved å gjennomføre en analyse med høyt innhold ved bruk av drebrin som avlesning, har vi nylig rapportert de hemmende effektene av fensyklidinanaloger på N-metyl-D-asparaginsyre-type glutamatreseptorer (NMDARs)10 og de NMDAR-avhengige effektene av naturlige forbindelser og rå stoffer på synaptiske tilstander15.
Her beskriver vi hvordan man dyrker frosne bestander av nevroner ved lav tetthet. I tillegg viser vi en drebrin imaging-basert evaluering av synaptisk tilstand ved hjelp av 96-brønnplater.
Et kritisk skritt i denne metoden er å tine cellesuspensjonen. Overføring av cellesuspensjonen før den blir for varm er svært viktig. For å unngå rask endring av osmolalitet må du imidlertid ikke overføre cellesuspensjonen til et stort volum av mediet samtidig. Dråpevis tilsetning av kulturmediet er også avgjørende for å unngå plutselige endringer i osmotisk trykk.
Nevronene kan dyrkes i andre kulturkar: 24-brønnsplater, 8-brønnskamre, 60 mm retter eller MED-sonder. I slike tilfeller må imidlertid den endelige konsentrasjonen og tidspunktet for tilsetning av Ara-C justeres. I tillegg må tettheten av nevroner optimaliseres i forskjellige typer eksperimenter. For eksempel kreves kultur med høy tetthet for elektrofysiologiske eksperimenter, og i så fall er medieutvekslingen nødvendig to ganger i uken (figur 6). Dermed krever en kultur med lav tetthet færre trinn enn en kultur med høy tetthet.
Neuronkultur med lav tetthet krever ofte forhåndsteknikker; Bruk av bruksklar frossen lager løser imidlertid dette problemet. Den beskrevne metoden er ikke avhengig av en eksperimenters ferdighet. Kvaliteten på frossen bestand er stabil og kan dyrkes stabilt så lenge de lagres i flytende nitrogen og unngår temperaturendringer i opptil 4 år.
Dyrking av cellene i 3 uker uten middels utveksling reiser spørsmålet om det er signifikante osmolalitetsendringer eller kulturmediefordampning. Vi har imidlertid bekreftet at fordampningen av kulturmediet er liten (reduksjonsgrad på 3,6%). Lokaliseringen av synaptiske proteiner og nevronens morfologi virker normal etter 3 uker. Derfor forårsaker 3-ukers kultur uten medieutveksling ikke store osmolalitetsendringer som påvirker forholdene til de dyrkede nevronene. Å holde platen i en inkubator etter Ara-C-behandling er også et viktig punkt som minimerer fordampning.
Det er ingen begrensning med hensyn til bruken av de frosne stamnevronene. Det er imidlertid noen begrensninger ved kulturmetoden med lav tetthet. Vi bekreftet at lavdensitetskulturen kunne brukes til morfologisk observasjon av nevroner, evaluering av synaptisk funksjon og GFP-transfeksjon. Vi har imidlertid ikke undersøkt levende celleavbildning. I tillegg, som nevnt ovenfor, er det nødvendig med høy tetthetskultur for å utføre elektrofysiologi.
Synapsemodning tar vanligvis 3 uker7, og vi kan ikke bekrefte at de dyrkede nevronene har riktige synapser til slutten. Hvis synapsemodningen ikke er god etter 3 uker, må vi dyrke igjen. Ved å vite kvaliteten på nevronene før vi starter forsøkene, kan vi spare disse 3 ukene. Derfor, for å utføre eksperimenter effektivt, er det best å sjekke kvaliteten på nevronene på forhånd. Frosne lagre gjør det mulig å sjekke kvaliteten på nevronene på forhånd. Hvert parti med fryste bestander genereres fra ett kull rotter, og vi kan bruke en av bestandene fra hver batch til en kvalitetskontroll. Drebrin er en god markør for kvalitetskontroll av nevronene. Som beskrevet akkumuleres drebrin i ryggraden i modne nevroner, og det reagerer på synaptisk stimulering. Dermed kan vi sjekke kvaliteten på nevronene i frosne lagre ved å bruke drebrin som markør.
Denne metoden kan brukes til å evaluere effekten av legemidler på synaptisk tilstand. Drebrin exodus fra dendritiske pigger forekommer i begynnelsen av synaptisk plastisitet22. Derfor viser påvisning av drebrin-klyngereduksjon fremkalt ved medikamentell behandling at stoffet stimulerer synapsen og forårsaker synaptisk plastisitet. Videre, for å identifisere om reduksjonen er NMDAR-avhengig, er et eksperiment med 2-amino-5-fosfonovalersyre (APV, en NMDAR-antagonist) nyttig. Ved å bruke drebrin som markør, er selv en NMDAR-avhengighet klart bestemt10,15. Den beskrevne metoden er nyttig i legemiddelundersøkelser, sikkerhetsfarmakologiske studier og evaluering av synaptisk funksjon.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Kazumi Kamiyama og Manami Kawada for hjelp med eksperimenter. Dette arbeidet ble støttet av JSPS KAKENHI (Grant Number 19K08010 to N.K.) og Japan Agency for Medical Research and Development (AMED) (Grant Number JP19bk0104077 og JP22bm0804024 til T.S.).
96 well plate | Zeon Corporation | Gifted | |
96 well plate | greiner | 655986 | |
Anti-drebrin antibody (M2F6) | MBL | D029-3 | Mouse monoclonal (dilution 1:1) |
Anti-MAP2 antibody | Millipore | AB5622 | Rabbit (dilution 1:1000) |
Anti-mouse Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A11031 | Dilution 1: 500 |
Anti-rabbit Alexa Fluor | Thermo Fisher Scientific | A11008 | Dilution 1: 500 |
B-27 | Gibco | 17504-044 | 2 v/v% for MEA plates; 50x for normal plates |
Borax | Sigma | B-9876 | Final concentration 12 mM |
Boric acid | WAKO | 021-02195 | Final concentration 50 mM |
Bovine serum albumin | Millipore | 12659-100G | Final concentration: 3% in PBS |
Confocal quantitative image cytometer CellVoyager CQ1 |
YOKOGAWA | Phase contrast images | |
Cytosine β-D-arabino-furanoside (Ara-C) | Sigma | C-6645 | Diluted in dH2O (final concentration: 0.2 µM) |
DAPI | FUJIFILM | 340-07971 | Dilution 1:1000 |
GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | 2.5 mM for MEA plates; 400x for normal plates |
In Cell Analyzer 2200 | Cytiva | Fluorescence images | |
Laminin | Sigma | 114956-81-9 | Final concentration: 20 µg/mL |
Maestro | Axion Biosystems | MEA recordings | |
MEA plate | Axion Biosystems | M768-tMEA-48W | |
Neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
Paraformaldehyde | nacalai tesque | 26126-25 | Final concentration: 4% in PBS |
Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | 100 U/mL for normal plates |
Penicillin/Streptomycin | nacalai tesque | 26253-84 | 100 µg/mL for MEA plates |
polyethyleimine | Sigma | 9002-98-6 | Final concentration: 0.1% |
Poly-L-lysine | Sigma | P2636 | Diluted in the borate buffer (final concentration: 1 mg/mL) |
SKY Neuron | AlzMed , Inc. | ARH001 | 1.0 x 106 cells/tube |
Sodium azide | FUJIFILM | 195-11092 | 0.1% |
SodiumL(+)-Glutamate monohydrate | WAKO | 194-02032 | Diluted in dH2O (final concentrations: 1 µM, 3 µM, 10 µM, 30 µM, 100 µM) |