Analisi dell'espressione genica nei follicoli umani

L’ovaio è un organo complesso composto da unità funzionali e strutturali, compresi i follicoli all’interno della corteccia e lo stroma. La follicologenesi, il processo di attivazione, crescita e maturazione del follicolo da uno stato quiescente primordiale a un follicolo maturo in grado di essere fecondato e di supportare lo sviluppo embrionale precoce, è ampiamente studiato nella ricerca¹. Svelare i meccanismi che guidano questo fenomeno potrebbe migliorare la cura della fertilità per le donne². Le analisi su tessuto umano fisso permettono di valutare l’espressione proteica e la localizzazione genica all’interno delle unità funzionali dell’ovaio ^3,4. Tuttavia, sono necessarie tecniche specifiche per dissociare i follicoli dalla corteccia circostante per valutare con precisione i livelli di espressione genica all’interno dei follicoli ovarici. Quindi, in uno studio precedente, è stata sviluppata una tecnica di isolamento del follicolo per consentire analisi dell’espressione genica direttamente dall’unità funzionale dell’ovaio⁵. Sono stati sviluppati diversi approcci, come la digestione enzimatica e/o l’isolamento meccanico, così come la microdissezione a cattura laser, che consente l’isolamento del follicolo all’interno di un pezzo di tessuto 6,7,8,9. L’isolamento del follicolo è ampiamente utilizzato, sia con tessuto ovarico umano che animale, per valutare i profili di espressione genica dei follicoli in tutte le fasi dello sviluppo^10,11,12. Tuttavia, una procedura di isolamento ottimale dovrebbe tenere conto della fragile struttura del follicolo all’interno della corteccia densa e, pertanto, dovrebbe essere eseguita con cura per evitare danni⁷. Questo manoscritto descrive una procedura, adattata da un protocollo descritto dal laboratorio di Woodruff, per isolare i follicoli umani dalla corteccia ovarica congelata e scongelata al fine di eseguire analisi di espressione genica¹³.

Il primo passo dell’isolamento del follicolo ovarico dal tessuto umano congelato è la procedura di scongelamento. Questo processo viene eseguito sulla base del protocollo clinico utilizzato per l’innesto di tessuto ovarico crioconservato, come precedentemente descritto^14,15. Il processo mira a rimuovere gli agenti crioprotettori risciacquando la corteccia ovarica in concentrazioni decrescenti del mezzo. Quindi, il tessuto viene frammentato prima dell’isolamento enzimatico e meccanico per recuperare i follicoli. I follicoli in diversi stadi possono essere distinti utilizzando uno stereomicroscopio ad alto ingrandimento e ottica di buona qualità per isolare quelli di interesse. Ogni follicolo isolato viene misurato utilizzando un righello integrato nel microscopio e i follicoli possono essere raggruppati in base al loro stadio di sviluppo: follicoli primordiali (30 μm), follicoli primari (60 μm), follicoli secondari (120-200 μm) e follicoli antrali (>200 μm)¹⁶. Un’ulteriore classificazione può essere eseguita in base alla morfologia dei follicoli: i follicoli primordiali hanno uno strato di cellule granulari appiattite (GC), i follicoli primari hanno uno strato di GC cuboidali, i follicoli secondari hanno almeno due strati di GC cuboidali e la presenza di una cavità tra i GC caratterizza lo stadio antrale. Quando vengono selezionati i follicoli di interesse, viene eseguita l’estrazione dell’RNA. La quantità e la qualità dell’RNA vengono valutate prima della reazione a catena della polimerasi quantitativa in tempo reale (RT-qPCR) (Figura 1).