Summary

Genexpressionsanalysen in humanen Follikeln

Published: February 17, 2023
doi:

Summary

Hier beschreiben wir ein Protokoll, das beschreibt, wie menschliche Ovarialfollikel aus gefrorenem und aufgetautem kortikalem Gewebe isoliert werden können, um Genexpressionsanalysen durchzuführen.

Abstract

Der Eierstock ist ein heterogenes Organ, das sich aus verschiedenen Zelltypen zusammensetzt. Um die molekularen Mechanismen während der Follikulogenese zu untersuchen, kann die Lokalisierung von Proteinen und Genexpression auf fixiertem Gewebe durchgeführt werden. Um die Genexpression in einem menschlichen Follikel richtig beurteilen zu können, muss diese komplexe und empfindliche Struktur jedoch isoliert werden. Daher wurde ein angepasstes Protokoll entwickelt, das zuvor von Woodruffs Labor beschrieben wurde, um die Follikel (die Eizelle und die Granulosazellen) von ihrer Umgebung zu trennen. Das kortikale Gewebe der Eierstöcke wird zunächst manuell bearbeitet, um kleine Fragmente mit zwei Werkzeugen zu erhalten: einem Gewebeschneider und einem Gewebezerkleinerer. Das Gewebe wird dann mit 0,2 % Kollagenase und 0,02 % DNase für mindestens 40 min enzymatisch verdaut. Dieser Aufschlussschritt wird bei 37 °C und 5 % CO2 durchgeführt und von einem mechanischen Pipettieren des Mediums alle 10 min begleitet. Nach der Inkubation werden die isolierten Follikel manuell mit einer kalibrierten Mikrokapillarpipette unter mikroskopischer Vergrößerung entnommen. Wenn noch Follikel in den Gewebestücken vorhanden sind, wird der Eingriff mit einer manuellen Mikrodissektion abgeschlossen. Die Follikel werden auf Eis in einem Nährmedium gesammelt und zweimal in Tröpfchen phosphatgepufferter Kochsalzlösung gespült. Dieser Verdauungsvorgang muss sorgfältig kontrolliert werden, um eine Verschlechterung der Follikel zu vermeiden. Sobald die Struktur der Follikel beeinträchtigt zu sein scheint oder nach maximal 90 Minuten, wird die Reaktion mit einer 4 °C heißen Blockierlösung gestoppt, die 10 % fötales Kälberserum enthält. Es sollten mindestens 20 isolierte Follikel (mit einer Größe unter 75 μm) entnommen werden, um nach der RNA-Extraktion eine ausreichende Menge an Gesamt-RNA für die quantitative Polymerase-Kettenreaktion in Echtzeit (RT-qPCR) zu erhalten. Nach der Extraktion erreicht die Quantifizierung der Gesamt-RNA aus 20 Follikeln einen Mittelwert von 5 ng/μL. Die gesamte RNA wird dann in cDNA retrotranskribiert und die interessierenden Gene werden mittels RT-qPCR weiter analysiert.

Introduction

Der Eierstock ist ein komplexes Organ, das aus funktionellen und strukturellen Einheiten besteht, einschließlich der Follikel innerhalb der Hirnrinde und des Stromas. Die Follikulogenese, der Prozess der Follikelaktivierung, des Wachstums und der Reifung von einem ursprünglichen Ruhezustand zu einem reifen Follikel, der befruchtet werden kann und die frühe Embryonalentwicklung unterstützt, wird in der Forschung umfassend untersucht1. Die Entschlüsselung der Mechanismen, die dieses Phänomen antreiben, könnte die Fruchtbarkeitsversorgung von Frauen verbessern2. Analysen an fixiertem menschlichem Gewebe ermöglichen die Beurteilung der Proteinexpression und der Genlokalisation innerhalb der funktionellen Einheiten des Ovars 3,4. Es sind jedoch spezielle Techniken erforderlich, um die Follikel von der umgebenden Hirnrinde zu trennen, um die Genexpression in den Eierstockfollikeln genau zu bestimmen. Daher wurde in einer früheren Studie eine Follikelisolationstechnik entwickelt, die Analysen der Genexpression direkt aus der funktionellen Einheit des Ovars ermöglicht5. Es wurden verschiedene Ansätze entwickelt, wie z. B. der enzymatische Aufschluss und/oder die mechanische Isolierung sowie die Laser-Capture-Mikrodissektion, die eine Follikelisolierung innerhalb eines Gewebestücks ermöglichen 6,7,8,9. Die Follikelisolierung wird häufig verwendet, entweder mit menschlichem oder tierischem Eierstockgewebe, um die Genexpressionsprofile von Follikeln in allen Entwicklungsstadien zu bewerten10,11,12. Ein optimales Isolationsverfahren sollte jedoch die fragile Struktur des Follikels innerhalb des dichten Kortex berücksichtigen und daher mit Sorgfalt durchgeführt werden, um Schäden zu vermeiden7. Dieses Manuskript beschreibt ein Verfahren, das von einem von Woodruffs Labor beschriebenen Protokoll adaptiert wurde, um menschliche Follikel aus gefrorener und aufgetauter Eierstockrinde zu isolieren, um Genexpressionsanalysen durchzuführen13.

Der erste Schritt der Isolierung der Eierstockfollikel aus gefrorenem menschlichem Gewebe ist das Auftauen. Dieser Prozess wird auf der Grundlage des klinischen Protokolls durchgeführt, das für die Transplantation von kryokonserviertem Eierstockgewebe verwendet wird, wie zuvor beschrieben14,15. Das Verfahren zielt darauf ab, die Kryoprotektiva zu entfernen, indem die Eierstockrinde in abnehmenden Konzentrationen des Mediums gespült wird. Anschließend wird das Gewebe fragmentiert, bevor es enzymatisch und mechanisch isoliert wird, um die Follikel zu gewinnen. Follikel in verschiedenen Stadien können mit einem Stereomikroskop mit hoher Vergrößerung und hochwertiger Optik unterschieden werden, um die interessierenden Follikel zu isolieren. Jeder isolierte Follikel wird mit einem in das Mikroskop integrierten Lineal gemessen, und die Follikel können nach ihrem Entwicklungsstadium zusammengefasst werden: Primordialfollikel (30 μm), Primärfollikel (60 μm), Sekundärfollikel (120-200 μm) und Antralfollikel (>200 μm)16. Eine weitere Klassifizierung kann nach der Morphologie der Follikel vorgenommen werden: primordiale Follikel haben eine Schicht abgeflachter Granulosazellen (GCs), primäre Follikel haben eine Schicht quaderförmiger GCs, sekundäre Follikel haben mindestens zwei Schichten quaderförmiger GCs, und das Vorhandensein eines Hohlraums zwischen den GCs charakterisiert das Antralstadium. Wenn die interessierenden Follikel ausgewählt werden, wird eine RNA-Extraktion durchgeführt. Die RNA-Quantität und -Qualität wird vor der quantitativen Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR) in Echtzeit bewertet (Abbildung 1).

Protocol

Dieses Projekt wurde von der Ethikkommission des Erasme-Krankenhauses (Brüssel, Belgien) genehmigt. Die in dieses Protokoll eingeschlossene Patientin unterzog sich vor der Chemotherapie im Jahr 2000 einer Kryokonservierung des Eierstockgewebes (OTC) zur Erhaltung der Fruchtbarkeit. Die Patientin unterschrieb eine schriftliche Einverständniserklärung, ihr verbleibendes gefrorenes Gewebe am Ende der Aufbewahrungsfrist für die Forschung zu spenden. 1. Auftauen von kryokonserviertem Eier…

Representative Results

Mit diesem Isolationsverfahren kann der Experimentator Follikel aus der Stromaumgebung entnehmen, um spezifische Genexpressionsanalysen durchzuführen. Anhand der Größe und Morphologie der Follikel ist es möglich, die verschiedenen Stadien der Follikulogenese zu unterscheiden. Der Experimentator kann die interessierenden Follikel entsprechend ihrer Größe mit einer angepassten Mikrokapillarpipette auswählen. Durch die Verwendung einer Mikrokapillare von maximal 75 μm ist es möglich, primordiale und primäre Follik…

Discussion

Die Kryokonservierung von Eierstockgewebe ist ein vielversprechender Ansatz, um die Fruchtbarkeit von Krebspatientinnen zu erhalten. In der Klinik wird aufgetautes kortikales Gewebe nach der Remission wieder in die Patientin transplantiert, was die Wiederaufnahme der Eierstockfunktion und der Fruchtbarkeit ermöglicht19,20. Neben der klinischen Verwendung können am Ende der Lagerzeit auch verbleibende Eierstockfragmente für die Forschung gespendet werden, um di…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde durch einen Excellence of Science (EOS) Grant (ID: 30443682) unterstützt. I.D. ist assoziierter Forscher am Fonds National de la Recherche Scientifique de Belgique (FNRS).

Materials

2 mm gridded Petri dish Corning 430196
2100 Bioanalyzer instrument Agilent G2939BA
2100 Expert software Agilent version B.02.08.SI648
4-wells plate Sigma Aldrich D6789
6-wells plate Carl Roth  EKX5.1
Agilent total RNA 6000 pico kit Agilent 5067-1513
Ascorbic acid Sigma Aldrich A4403
Aspirator tube assemblies for microcapillary pipettes Sigma Aldrich A5177
Centrifuge Eppendorf 5424R
Collagenase IV LifeTechnologies 17104-019
DMSO Sigma Aldrich D2650
DNase Sigma Aldrich D4527-10kU
FBS Gibco 10270-106
GoScript reverse transcriptase Promega A5003
HSA CAF DCF  LC4403-41-080
Leibovitz-15 LifeTechnologies 11415-049
L-Glutamine Sigma Aldrich G7513
McCoy’s 5A + bicarbonate + Hepes LifeTechnologies 12330-031
McIlwain tissue chopper Stoelting 51350
Microcapillary RI EZ-Tips 200 µm CooperSurgical 7-72-2200/1
Microcapillary RI EZ-Tips 75 µm CooperSurgical 7-72-2075/1
NanoDrop 2000/2000c operating software ThermoFisher version 1.6
NanoDrop spectrophotometer ThermoFisher 2000/2000c
Penicillin G Sigma Aldrich P3032
PowerTrack SYBR green master mix ThermoFisher A46109
Primers: GDF9 F: CCAGGTAACAGGAATCCTTC R: GGCTCCTTTATCATTAGATTG
Primers: HPRT F: CCTGGCGTCGTGATTAGTGAT R: GAGCACACAGAGGGCTACAA
Primers: Kit Ligand F: TGTTACTTTCGTACATTGGCTGG R: AGTCCTGCTCCATGCAAGTT
Real-Time qPCR Quantstudio 3 ThermoFisher A33779
RNAqueous-micro total RNA isolation kit ThermoFisher AM1931
Selenium Sigma Aldrich S9133
Sodium pyruvate Sigma Aldrich S8636
Stereomicroscope Nikon SMZ800
Streptomycine sulfate Sigma Aldrich S1277
Sucrose Sigma Aldrich S1888
Thermo Scientific Forma Series II  water-jacketed CO2 incubators ThermoFisher 3110
Thomas Stadie-Riggs tissue slicer Thomas Scientific 6727C10
Transferrin Roche  10652202001

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Citazione di questo articolo
Devos, M., Dias Nunes, J., Demeestere, I. Gene Expression Analyses in Human Follicles. J. Vis. Exp. (192), e64807, doi:10.3791/64807 (2023).

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