Aislamiento no acuoso y enriquecimiento de tricomas glandulares capitados y sésiles de Cannabis sativa
Summary
Se presenta un protocolo para el aislamiento y enriquecimiento conveniente y de alto rendimiento de tricomas glandulares capitados y sésiles de Cannabis sativa. El protocolo se basa en una extracción seca y sin tampón de tricomas utilizando solo nitrógeno líquido, hielo seco y tamices de nylon y es adecuado para la extracción de ARN y el análisis transcriptómico.
Abstract
Este documento presenta un protocolo para el aislamiento y enriquecimiento conveniente y de alto rendimiento de tricomas glandulares capitados y sésiles de Cannabis sativa. Las vías biosintéticas para el metabolismo de los cannabinoides y los terpenos volátiles se localizan principalmente en los tricomas del cannabis , y los tricomas aislados son beneficiosos para el análisis del transcriptoma. Los protocolos existentes para aislar tricomas glandulares para la caracterización transcriptómica son inconvenientes y proporcionan cabezas de tricomas comprometidas y una cantidad relativamente baja de tricomas aislados. Además, dependen de aparatos costosos y medios de aislamiento que contienen inhibidores de proteínas para evitar la degradación del ARN. El presente protocolo sugiere combinar tres modificaciones individuales para obtener una gran cantidad de tricomas glandulares capitados y sésiles aislados de inflorescencias femeninas maduras de C. sativa y hojas de abanico, respectivamente. La primera modificación consiste en sustituir el nitrógeno líquido por el medio de aislamiento convencional para facilitar el paso de tricomas a través de los microtamices. La segunda modificación consiste en usar hielo seco para separar los tricomas de la fuente vegetal. La tercera modificación consiste en pasar el material vegetal consecutivamente a través de cinco micro-tamices de tamaños de poro decrecientes. Las imágenes microscópicas demostraron la efectividad de la técnica de aislamiento para ambos tipos de tricomas. Además, la calidad del ARN extraído de los tricomas aislados fue apropiada para el análisis transcriptómico posterior.
Introduction
Los tricomas glandulares son estructuras similares a pelos presentes en las plantas que contienen muchos metabolitos secundarios1 y representan un valioso banco de nuevos genes biosintéticos y enzimas2. En el cannabis, la biosíntesis de los metabolitos secundarios importantes, los cannabinoides3 y los terpenos4, se localiza en los tricomas. Teniendo en cuenta el papel de los tricomas en la determinación de la calidad del cannabis tanto para usos medicinales como recreativos, el estudio de la expresión génica de tricomas es de interés. Para caracterizar la expresión de genes específicos de tricomas, primero se deben aislar los tricomas de interés. Los protocolos de aislamiento de tricomas se describieron por primera vez ya en 19925, y sus últimos desarrollos han sido revisados recientemente2. En general, los protocolos para extraer tricomas glandulares para la caracterización transcriptómica se pueden dividir en dos pasos secuenciales distintos. El primer paso implica una separación física completa de los tricomas del tejido vegetal. Este paso se puede realizar utilizando hielo seco5, perlas de vidrio con un aparato comercial 6,7, moliendo el material vegetal contra un tamiz de malla8, o vórtice del tejido vegetal en un tampón de aislamiento9. El segundo paso implica una separación más refinada de los tricomas de interés del residuo microscópico de la planta y / u otros tipos de tricomas. Este paso se puede ejecutar utilizando centrifugación por gradiente de densidad 8,10 o tamices de varios tamaños 7,9. Debido a la extrema sensibilidad del ARN en los tejidos procesados a los agentes degradantes, estos dos pasos secuenciales generalmente se realizan en el medio de aislamiento helado, a menudo en presencia de inhibidores de proteínas4.
Los protocolos convencionales de aislamiento de tricomas requieren, además de las temperaturas heladas, grandes cantidades de medio de aislamiento para garantizar un procedimiento de extracción eficiente. La combinación de estos componentes da como resultado un proceso de aislamiento arduo y lento que dificulta el alto rendimiento. Por lo tanto, es probable que la presentación de un protocolo alternativo de aislamiento de tricomas sencillo y fácil de usar sea beneficioso para varios aspectos asociados con la caracterización de tricomas. El presente trabajo tiene como objetivo ofrecer un protocolo alternativo para aislar tricomas capitados glandulares tallados y sésiles de Cannabis sativa mediante la combinación e integración de varios elementos de los protocolos convencionales. Estos elementos incluyen el hielo seco5, el paso de los tricomas a través de varios microtamices con tamaños de poro decrecientes7,9, y la sustitución del nitrógeno líquido (LN) por el medio de aislamiento8.
La novedad del actual protocolo de aislamiento de tricomas, en comparación con los protocolos convencionales, se presenta de varias maneras. Este protocolo es conveniente, ya que no requiere componentes peligrosos. El procedimiento se puede realizar en el laboratorio con precauciones mínimas y facilita un alto rendimiento. La sustitución del medio de aislamiento líquido estándar por LN garantiza la integridad de los tricomas durante todo el proceso de aislamiento, lo que permite un posterior análisis transcriptómico. Tras la sublimación del LN y el hielo seco, los tricomas aislados quedan libres de residuos dañinos. Además, la propensión de LN a sublimar a temperatura ambiente permite su uso generoso en todo el protocolo. Por el contrario, el uso de grandes volúmenes de medio de aislamiento convencional genera dificultades prácticas en su manejo. Finalmente, el protocolo disminuye la separación de la célula del disco de la frágil estructura de la cabeza restante del tricoma glandular, lo que permite la retención del contenido del espacio de cabeza.
Este protocolo se presenta de manera detallada paso a paso diseñado para ayudar a la práctica técnica de aislar tricomas capitales glandulares de C. sativa. El protocolo proporciona un flujo de trabajo manejable que da como resultado tricomas aislados con una alta concentración y pureza que son apropiados para el análisis molecular posterior.
Protocol
Representative Results
Discussion
En comparación con los protocolos de aislamiento de tricomas actualmente disponibles, en el presente protocolo se describen dos modificaciones principales. Estos incluyen el desprendimiento de los tricomas del material vegetal utilizando hielo seco en el paso inicial y la sustitución de LN por el medio tampón líquido comúnmente utilizado. La primera modificación para la purificación de tricomas de C. sativa se basa en un protocolo anterior que introdujo el uso de hielo seco picado para separar los tricoma…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores reconocen el apoyo financiero de CannabiVar Ltd. Todo el material vegetal fue generosamente proporcionado por el profesor Hinanit Koltai del Centro Volcani, Israel.
Materials
| Bioanalyzer RNA Pico 6000 chip | Agilent, Germany | Reorder number 5067-1513 | Lab-on-a-chip system |
| Transsonic-310 | Elma, Germany | D-78224 | Ultrasonic cleaning unit |
| TruSeq RNA Sample Prep Kit v2 | Illumina, USA | RS-122-2001 | Sample preperation for RNA sequencing library |
| Spectrum Plant Total RNA Kit | SIGMA-ALDRICH, USA | STRN50-1KT | Plant Total RNA Kit |
| Nylon micro-sieve with a mesh size of 350 µm (40 x 40 cm or larger than the circumference of the flour sifter) | Sinun Tech, Israel | r0350n350210 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size of 150 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0150n360465 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size o 105 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0105n320718 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size o 80 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0080n370465 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size o 65 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0065n340715 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size o 50 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0080n370465 | Nylon screen aperture |
| Up to 10 g of frozen plant material (stored in -80 oC or liquid nitrogen) | |||
| Suitable gloves for handling low temperatures | |||
| Safety goggles | |||
| 1 mm screen door (mosquito) mesh (strip of 30 x 100 cm) | |||
| Large strainer (colander) with holes approximately 5 mm | |||
| 1 L glass beaker | |||
| 1 block of dry ice (0.5-1 kg) | |||
| Hammer and hard flat object | |||
| Two 5 L plastic containers | |||
| Rubber bands | |||
| Large flour sifter or sieve strainer- preferably one with a detachable plastic ring on the circumference | |||
| Several large and small round bottom stainless steel containers. One of them should be larger than the flour sifter's circumference (approximately 40 cm in diameter), to minimize the loss of the sifted mass outside the round bottome stainless steel container | |||
| Pre-chilled (via liquid nitrogen) stainless steel spoon, spatula, and scoopula | |||
| Clean plate | |||
| Several clothespins | |||
| Pre-chilled (via liquid nitrogen) labeled 1.5 mL tubes with holes poked on the lid with a sterile needle | |||
| Two containers of liquid nitrogen | |||
| 1 cm wide painting brush |
Riferimenti
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