Transfert adoptif de macrophages stimulés par l’IL-33 dans des modèles murins induits par la bléomycine pour étudier leur effet sur la fibrose pulmonaire idiopathique in vivo
Summary
Ce protocole décrit l’isolement des macrophages interstitiels pulmonaires (IM) et leur transfert adoptif après stimulation IL-33 des alvéoles pulmonaires dans un modèle murin, ce qui peut faciliter l’étude in vivo de la fibrose pulmonaire idiopathique (FPI).
Abstract
La réponse inflammatoire causée par une lésion pulmonaire précoce est l’une des causes importantes du développement de la fibrose pulmonaire idiopathique (FPI), qui s’accompagne de l’activation de cellules inflammatoires telles que les macrophages et les neutrophiles, ainsi que de la libération de facteurs inflammatoires, notamment le TNF-α, l’IL-1β et l’IL-6. L’inflammation précoce causée par des macrophages interstitiels pulmonaires (IM) activés en réponse à la stimulation de l’IL-33 est connue pour jouer un rôle essentiel dans le processus pathologique de la FPI. Ce protocole décrit le transfert adoptif des IM stimulées par l’IL-33 dans les poumons de souris pour étudier le développement de la FPI. Il implique l’isolement et la culture de MI primaires à partir des poumons de souris hôtes, suivis du transfert adoptif de MI stimulés dans les alvéoles de souris receveuses de FPI induites par la bléomycine (BLM) (qui ont été précédemment appauvries en macrophages alvéolaires par un traitement avec des liposomes clodronates), et l’évaluation pathologique de ces souris. Les résultats représentatifs montrent que le transfert adoptif de macrophages stimulés par l’IL-33 aggrave la fibrose pulmonaire chez la souris, suggérant que la mise en place de l’expérience de transfert adoptif de macrophages est un bon moyen technique d’étudier la pathologie de la FPI.
Introduction
La fibrose pulmonaire idiopathique (FPI) est une maladie inflammatoire pulmonaire diffuse causée par de nombreux facteurs1. Dans le microenvironnement des cytokines de la réponse immunitaire Th1 et Th2, les macrophages peuvent être polarisés en macrophages classiquement activés (M1) et en macrophages activés (M2). Les lipopolysaccharides (LPS) ou la cytokine IFN-γ induisent les macrophages M1 à polariser et à produire des cytokines pro-inflammatoires, notamment iNOS, IL-1, IL-6, TNF-α et IL-12. En revanche, les cytokines de type II IL-4 et IL-13 entraînent la polarisation des macrophages M2, qui peuvent produire différents facteurs favorisant la croissance des fibroblastes, tels que le TGF-β et le PDGF, qui favorisent la fibrose pulmonaire2. Le processus pathologique de la FPI s’accompagne d’une activation et d’une infiltration des macrophages. La FPI intervient dans la réparation des blessures, l’inflammation et la fibrose par la libération de cytokines3. Comme seules des options thérapeutiques limitées sont disponibles, l’exploration des mécanismes pathologiques moléculaires de la FPI revêt une grande importance pour le développement de nouvelles stratégies de prévention et de traitement de la FPI. Des études antérieures menées par notre groupe et d’autres chercheurs 4,5 ont confirmé la libération accrue d’IL-33 chez les patients atteints de FPI et dans des modèles murins atteints de FPI induite par la bléomycine (BLM). L’IL-33 est libérée par les cellules épithéliales et endothéliales lors de la fibrose et est impliquée dans l’activation des macrophages, entraînant la prolifération anormale des fibroblastes, l’infiltration des leucocytes et la perte éventuelle de la fonction pulmonaire5. Le protocole actuel décrit le transfert adoptif de macrophages interstitiels (IM) stimulés par l’IL-33 dans les alvéoles comme moyen d’étudier le développement de la FPI dans des modèles murins. Ici, les IM ont été isolés du tissu pulmonaire de souris hôtes, cultivés in vitro, stimulés avec de l’IL-33 pendant 24 h, puis transférés adoptivement dans les alvéoles de souris receveuses par injection trachéale. La collecte directe de macrophages de souris stimulés et leur transfert adoptif dans les alvéoles receveuses se sont avérés aggraver le degré de fibrose pulmonaire et peuvent illustrer plus clairement l’influence des facteurs stimulants sur la fibrose par rapport aux études précédentes6. La technique décrite dans cet article peut permettre aux chercheurs d’explorer la fonction des macrophages stimulés par des cytokines potentielles dans le développement de la FPI.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cette étude fournit une méthode efficace pour épuiser, isoler, cultiver et transférer les macrophages, ce qui peut aider à étudier les mécanismes de la fibrose pulmonaire chez la souris. Il existe de nombreuses méthodes pour la déplétion des macrophages de souris, telles que l’administration trachéale, l’injection de veines de la queue et l’inhalation nasale11. Cette étude a optimisé la méthode d’inhalation nasale, simple à utiliser et capable d’épuiser efficacement les m…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs reconnaissent le sujet spécial de la gestion de laboratoire de l’Université de Jiangnan: construction d’une bibliothèque de tranches numériques basée sur des spécimens pathologiques (JDSYS202223) et de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (81800065).
Materials
| DMEM | Life technologies Biotechnology,USA | 1508012 | |
| Arterial indwelling needle | B Braun Melsingen AG,Germany | 21G15G8393 | |
| BD Accuri C6 Plus | Becton Dickinson,USA | ||
| Bleomycin | Biotang, USA | Ab9465 | |
| Carbon dioxide incubator | Thermo Forma, USA | Thermo Forma370 | |
| CD11b | R&D Systems,USA | 1124F | |
| CD11c | R&D Systems,USA | N418 | |
| Cell culture dish | Thermo Forma, USA | 174926 | |
| Clodronate liposomes | Clodronate liposomes,Netherlands | CI-150-150 | |
| Collagenase A | Sigma-Aldrich, USA | 10103578001 | |
| F4/80 | R&D Systems,USA | 521204 | |
| Falcon Cell Strainer | Becton,Dickinson and Company, USA | 352340 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Life technologies,USA | 1047571 | |
| Hematoxylin Eosin | Nanjing Jiancheng Technology,China | 06-570 | |
| LightCycler 480 PCR detection system | Roche, USA | ||
| Murine recombinant factor IL-33 | Peprotech, USA | 210-33 | |
| Nikon microscope | Nikon Corporation, Japan | 941185 | |
| Penicillin, streptomycin | Life technologies,USA | 877113 | |
| Phosphate buffer (PBS) | Guangdong Huankai Microbial Technology ,China | 1535882 | |
| RBC lysis buffer | Beyotime Biotechnology Company,China | C3702 | |
| RNA Isolater | Vazyme company,China | R401-01-AA | Total RNA extraction reagent |
| RWD Inhalation Anesthesia Machine | Shenzhen Rayward Life Technology ,China | R500 | |
| Semi-automatic paraffin slicer | Leica, Germany | LeicaRM2245 | |
| SYBR Premix Ex Taq | Takara, Japan | 410800 | |
| Trypsin 0.25% | Life Technologies, USA | 1627172 |
Riferimenti
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