Drosophila melanogaster'de Endojen Gen Etiketleme için Tek Adımlı CRISPR Tabanlı Strateji
Summary
Burada, başarılı genetik modifikasyonların işaretsiz tanımlanması için PCR tabanlı bir teknik kullanan ve stabil knock-in hatlarının geliştirilmesini kolaylaştıran Drosophila için basitleştirilmiş bir endojen gen etiketleme protokolü sunuyoruz.
Abstract
Canlı hücrelerde protein hücre altı lokalizasyonu, dinamikleri ve regülasyonu üzerine yapılan çalışmalar, floresan füzyon proteinleri üretmek için endojen genlerin etiketlenmesine izin veren tekniklerin ortaya çıkmasıyla derinden dönüştürülmüştür. Bu yöntemler, araştırmacıların protein davranışını gerçek zamanlı olarak görselleştirmelerini sağlayarak, hücresel ortamdaki işlevleri ve etkileşimleri hakkında değerli bilgiler sağlar. Mevcut birçok gen etiketleme çalışması, ilk adımda genetiği değiştirilmiş organizmaları tanımlamak için göz rengi değişiklikleri gibi görünür belirteçlerin kullanıldığı ve ikinci adımda görünür işaretleyicinin eksize edildiği iki aşamalı bir süreç kullanır. Burada, Drosophila melanogaster’de hassas ve hızlı endojen gen etiketlemesi gerçekleştirmek için tek adımlı bir protokol sunuyoruz, bu da görünür göz işaretleyicisi olmadan tasarlanmış hatların taranmasını sağlar ve geçmiş yöntemlere göre önemli bir avantaj sunar. Başarılı gen etiketleme olaylarını taramak için, orta bacaklarından küçük bir segmenti analiz ederek tek tek sinekleri genotiplemek için PCR tabanlı bir teknik kullanıyoruz. Tarama kriterlerini geçen sinekler daha sonra istikrarlı stoklar üretmek için kullanılır. Burada, CRISPR düzenleme plazmitlerinin tasarımını ve yapımını ve mühendislik hatlarının taranması ve doğrulanması için yöntemleri detaylandırıyoruz. Birlikte, bu protokol Drosophila’da endojen gen etiketlemesinin etkinliğini önemli ölçüde artırır ve in vivo hücresel süreçlerin incelenmesini sağlar.
Introduction
Floresan proteinler, canlı organizmalardaki hücrelerde protein lokalizasyonunu, dinamiklerini ve protein-protein etkileşimlerini görselleştirmek için güçlü araçlar olarak ortaya çıkmıştır 1,2. Endojen genlerin floresan proteinlerle etiketlenmesi, hücresel süreçlerin hücre altı çözünürlükle uzun süreli canlı görüntülenmesini sağlar. Ayrıca, bu endojen gen etiketleme teknikleri, aşırı ekspresyon ve immün boyama yaklaşımlarına kıyasla çeşitli avantajlara sahiptir. Örneğin, proteinlerin aşırı ekspresyonu, proteinin yanlış katlanmasına, spesifik olmayan protein-protein etkileşimlerine ve yanlış lokalizasyonayol açabilir 3. Bugüne kadar, araştırmacılar, verimli homolog rekombinasyona maruz kalabilen tomurcuklanan maya gibi birkaç model organizma için floresan proteinlere kaynaşmış endojen genlerin geniş kütüphanelerini oluşturabildiler4. Drosophila melanogaster durumunda, genleri floresan olarak etiketlemek için MiMICs5, transpozon tabanlı arttırıcı tuzaklar6 ve fosmidler7 gibi çeşitli araçlar tasarlanmıştır.
CRISPR-Cas9 tabanlı araçların geliştirilmesi, çok çeşitli model organizmalardaendojen proteinlerin etiketlenmesi de dahil olmak üzere genom düzenlemesini verimli bir şekilde gerçekleştirmeyi mümkün kılmıştır 8,9. Cas9, çift sarmallı DNA’yı oldukça verimli ve spesifik bir şekilde parçalayanRNA kılavuzlu bir enzimdir 8, daha sonra nokta mutasyonlarına veya delesyonlara yol açan homolog olmayan bir uç birleştirme (NHEJ) yolu ile onarılabilir. Alternatif olarak, homolojiye yönelik onarım (HDR) yolu, heterolog DNA’nın kromozoma entegrasyonuna izin verir.
Model organizma Drosophila melanogaster’de CRISPR tabanlı gen etiketleme için geçmiş yöntemler, iki aşamalı bir sürecedayanmaktadır 10,11,12. Bu, başarılı HDR olaylarını tespit etmek için fark edilebilir bir göz rengi işaretleyicisi olan Dsred’in kullanılmasını içerir. Daha sonra, Dsred markörü Cre / loxP rekombinasyon sistemi kullanılarak eksize edilecektir. Bu süreci kolaylaştırmak ve hızlandırmak için burada daha basit ve daha verimli bir yöntem sunuyoruz. Bu yaklaşım, ölümcül genotipleme ihtiyacını ortadan kaldırır ve bireysel sineklerin doğrudan taranmasına izin verir. Spesifik olarak, sineğin orta bacağının küçük bir bölümünden DNA çıkarmak için PCR tabanlı bir yaklaşım kullanıyoruz ve bu da tek tek sinekleri genotiplememize izin veriyor. Özellikle, bu prosedür, örneklenen sineğin canlılığını, hareketini veya üreme yeteneklerini tehlikeye atmaz. Yalnızca bu yöntemle belirlenen uygun kişiler, istikrarlı hisse senetlerine dönüştürülür.
Burada, endojen genlerin floresan raportörlerle etiketlendiği floresan protein etiketli sinekler üretmek için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Bu teknik, istenen herhangi bir florofor etiketini endojen bir genin N- veya C- terminaline kaynaştırmak için CRISPR-Cas9 genom düzenlemesini kullanır. Aşağıda, gRNA plazmitlerinin ve bir donör plazmidinin tasarımını ve yapımını, CRISPR pozitif sinekleri seçmek için tek adımlı tarama stratejisini ve kararlı çizgiler oluşturma adımlarını açıklıyoruz. Spesifik olarak, endojen bir çekirdek saat Drosophila genini, dönemi, C-terminalinde bir florofor ile etiketleme stratejilerini açıklıyoruz. Ayrıca, etiketli proteinin işlevsel olduğunu doğrulamak için yapılması gereken kontrol deneylerini ve bozulmamış Drosophila beyinleri13 içindeki canlı saat nöronlarında Periyot proteinini görselleştirmek için canlı görüntüleme tekniklerini kısaca açıklıyoruz. Burada açıklanan protokol, CRISPR-Cas9 genom düzenlemesi ile belirli DNA bitlerinin silinmesi ve eklenmesi için tarama adaylarına da geniş ölçüde uygulanabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sonuçlar, Drosophila’daki endojen genleri etiketlemek için aerodinamik, basit, tek adımlı CRISPR tabanlı bir stratejiyi göstermektedir. Protokolde, DNA çift sarmallı kırılmayı ve homolog rekombinasyonu daha verimli bir şekilde indüklemek için iki gRNA kullanıyoruz. gRNA’lar ve donör plazmid, germ hatlarında Cas9 enzimini eksprese eden meyve sineği embriyolarına enjekte edilir. Bu embriyolar daha sonra yetişkinliğe kadar standart koşullar altında yetiştirilir ve bu noktada birinci nesil (F…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Protokol geliştirmenin ilk aşamalarındaki tartışmalar için George Watase ve Josie Clowney’e teşekkür ederiz. Çalışma, NIH (S.Y.’ye hibe no. R35GM133737), Alfred P. Sloan Bursu (S.Y.’ye) ve McKnight Scholar Ödülü’nden (S.Y.’ye) sağlanan fonlarla desteklenmiştir.
Materials
| 0.5M EDTA pH8.0 | Invitrogen | AM9260G | |
| 5-alpha Competent E. coli (High Efficiency) | NEB | C2987H | |
| 96-well deep well plate | BRAND | 701354 | |
| Agar | Fisher Scientific | BP1423-500 | |
| BbsI-HF | NEB | R3539S | |
| DreamTaq Green PCR Master Mix (2X) | Thermo Scientific | K1081 | |
| D-Sucrose | Fisher Scientific | BP220-1 | |
| EcoRI-HF | NEB | R3101S | |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A142-212 | |
| Prolong Glass Antifade Mounting Medium | Invitrogen | P36982 | |
| Proteinase K | QIAGEN | 19131 | |
| Schneider's Drosophila Medium | Gibco | 21720001 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-500 | |
| T4 DNA ligase | NEB | M0202S | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-500 | |
| XbaI | NEB | R0145S |
Riferimenti
- Chudakov, D. M., Matz, M. V., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues. Physiol Rev. 90 (3), 1103-1163 (2010).
- Costantini, L. M., et al. A palette of fluorescent proteins optimized for diverse cellular environments. Nat Commun. 6, 7670 (2015).
- Gibson, T. J., Seiler, M., Veitia, R. A. The transience of transient overexpression. Nat Methods. 10 (8), 715-721 (2013).
- Huh, W. K., et al. Global analysis of protein localization in budding yeast. Nature. 425 (6959), 686-691 (2003).
- Venken, K. J., et al. MiMIC: a highly versatile transposon insertion resource for engineering Drosophila melanogaster genes. Nat Methods. 8 (9), 737-743 (2011).
- Quinones-Coello, A. T., et al. Exploring strategies for protein trapping in Drosophila. Genetica. 175 (3), 1089-1104 (2007).
- Sarov, M., et al. A genome-wide resource for the analysis of protein localisation in Drosophila. Elife. 5, e12068 (2016).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8, 2281-2308 (2013).
- Port, F., Chen, H. M., Lee, T., Bullock, S. L. Optimized CRISPR/Cas tools for efficient germline and somatic genome engineering in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (29), E2967-E2976 (2014).
- Gratz, S. J., et al. Highly specific and efficient CRISPR/Cas9-catalyzed homology-directed repair in Drosophila. Genetica. 196 (4), 961-971 (2014).
- Kanca, O., et al. An efficient CRISPR-based strategy to insert small and large fragments of DNA using short homology arms. Elife. 8, e51539 (2019).
- Lamb, A. M., Walker, E. A., Wittkopp, P. J. Tools and strategies for scarless allele replacement in Drosophila using CRISPR/Cas9. Fly (Austin). 11 (1), 53-64 (2017).
- Xiao, Y., Yuan, Y., Jimenez, M., Soni, N., Yadlapalli, S. Clock proteins regulate spatiotemporal organization of clock genes to control circadian rhythms. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (28), e2019756118 (2021).
- Costantini, L. M., Fossati, M., Francolini, M., Snapp, E. L. Assessing the tendency of fluorescent proteins to oligomerize under physiologic conditions. Traffic. 13 (5), 643-649 (2012).
- Snapp, E. L. Fluorescent proteins: a cell biologist’s user guide. Trends Cell Biol. 19 (11), 649-655 (2009).
- Kanca, O., et al. An expanded toolkit for Drosophila gene tagging using synthesized homology donor constructs for CRISPR-mediated homologous recombination. Elife. 11, e76077 (2022).
- Nitabach, M. N., Taghert, P. H. Organization of the Drosophila circadian control circuit. Curr Biol. 18 (2), R84-R93 (2008).
- Carvalho, G. B., Ja, W. W., Benzer, S. Non-lethal PCR genotyping of single Drosophila. Biotechniques. 46 (4), 312-314 (2009).
- Gummadova, J. O., Coutts, G. A., Glossop, N. R. J. Analysis of the Drosophila Clock promoter reveals heterogeneity in expression between subgroups of central oscillator cells and identifies a novel enhancer region. J Biol Rhythms. 24 (5), 353-367 (2009).
