Strategia basata su CRISPR in un'unica fase per il tagging genico endogeno in Drosophila melanogaster

Le proteine fluorescenti sono emerse come potenti strumenti per visualizzare la localizzazione, la dinamica e le interazioni proteina-proteina nelle cellule all’interno degli organismi viventi ^1,2. L’etichettatura di geni endogeni con proteine fluorescenti consente l’imaging dal vivo a lungo termine dei processi cellulari con risoluzione subcellulare. Inoltre, queste tecniche di marcatura genica endogena presentano diversi vantaggi rispetto agli approcci di sovraespressione e immunocolorazione. Ad esempio, la sovraespressione delle proteine potrebbe portare a un misfolding proteico, a interazioni proteina-proteina non specifiche e a un’errata localizzazione³. Ad oggi, i ricercatori sono stati in grado di creare vaste librerie di geni endogeni fusi a proteine fluorescenti per alcuni organismi modello, come il lievito in gemmazione, che possono subire un’efficiente ricombinazione omologa⁴. Nel caso di Drosophila melanogaster, sono stati messi a punto vari strumenti come le MiMICs⁵, le trappole enhancer⁶ basate su trasposoni e i fosmidi⁷ per marcare i geni in modo fluorescente.

Lo sviluppo di strumenti basati su CRISPR-Cas9 ha reso possibile eseguire in modo efficiente l’editing del genoma, compresa la marcatura di proteine endogene, in un’ampia gamma di organismi modello ^8,9. Cas9 è un enzima guidato dall’RNA che scinde il DNA a doppio filamento in modo altamente efficiente e specifico⁸, che può quindi essere riparato da una via di giunzione non omologa (NHEJ) che porta a mutazioni puntiformi o delezioni. In alternativa, la via di riparazione diretta dall’omologia (HDR) consente l’integrazione del DNA eterologo nel cromosoma.

I metodi precedenti per la marcatura genica basata su CRISPR nell’organismo modello, Drosophila melanogaster, si sono basati su un processo in due fasi 10,11,12. Ciò comporta l’utilizzo di un marcatore del colore degli occhi distinguibile, Dsred, per rilevare eventi HDR di successo. Successivamente, il marcatore Dsred verrebbe asportato utilizzando il sistema di ricombinazione Cre/loxP. Per semplificare e accelerare questo processo, qui presentiamo un metodo più semplice ed efficiente. Questo approccio aggira la necessità di genotipizzazione letale e consente lo screening diretto dei singoli moscerini. In particolare, impieghiamo un approccio basato sulla PCR per estrarre il DNA da un piccolo segmento della zampa centrale della mosca, consentendoci di genotipizzare i singoli moscerini. In particolare, questa procedura non compromette la vitalità, il movimento o le capacità riproduttive della mosca campionata. Solo gli individui appropriati, identificati attraverso questo metodo, vengono ulteriormente sviluppati in stock stabili.

Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per la generazione di mosche marcate con proteine fluorescenti in cui i geni endogeni sono marcati con reporter fluorescenti. Questa tecnica utilizza l’editing del genoma CRISPR-Cas9 per fondere qualsiasi tag fluoroforo desiderato al terminale N o C di un gene endogeno. Di seguito, descriviamo la progettazione e la costruzione di plasmidi gRNA e di un plasmide donatore, la strategia di screening in un’unica fase per selezionare i moscerini positivi a CRISPR e i passaggi per stabilire linee stabili. In particolare, descriviamo strategie per marcare un gene endogeno dell’orologio centrale della Drosophila, punto, con un fluoroforo al C-terminale. Descriviamo anche brevemente gli esperimenti di controllo che devono essere eseguiti per confermare che la proteina marcata è funzionale e tecniche di imaging dal vivo per visualizzare la proteina del periodo nei neuroni dell’orologio vivo all’interno di cervelli intatti di Drosophila ¹³. Il protocollo qui descritto è anche ampiamente applicabile ai candidati allo screening per le delezioni e gli inserimenti di specifici frammenti di DNA mediante l’editing del genoma CRISPR-Cas9.