Einstufige CRISPR-basierte Strategie zur endogenen Genmarkierung in Drosophila melanogaster
Summary
Hier stellen wir ein vereinfachtes endogenes Gen-Tagging-Protokoll für Drosophila vor, das eine PCR-basierte Technik zur markerfreien Identifizierung erfolgreicher genetischer Veränderungen verwendet und die Entwicklung stabiler Knock-in-Linien erleichtert.
Abstract
Die Untersuchung der subzellulären Lokalisierung, Dynamik und Regulation von Proteinen in lebenden Zellen hat sich durch das Aufkommen von Techniken, die die Markierung endogener Gene zur Herstellung fluoreszierender Fusionsproteine ermöglichen, grundlegend verändert. Diese Methoden ermöglichen es Forschern, das Verhalten von Proteinen in Echtzeit zu visualisieren und wertvolle Einblicke in ihre Funktionen und Wechselwirkungen in der zellulären Umgebung zu erhalten. Viele aktuelle Genmarkierungsstudien verwenden einen zweistufigen Prozess, bei dem sichtbare Marker, wie z. B. Veränderungen der Augenfarbe, verwendet werden, um genetisch veränderte Organismen im ersten Schritt zu identifizieren, und der sichtbare Marker im zweiten Schritt herausgeschnitten wird. Hier stellen wir ein einstufiges Protokoll zur präzisen und schnellen endogenen Genmarkierung in Drosophila melanogaster vor, das ein Screening auf manipulierte Linien ohne sichtbaren Augenmarker ermöglicht und einen erheblichen Vorteil gegenüber früheren Methoden bietet. Um nach erfolgreichen Gen-Tagging-Ereignissen zu suchen, verwenden wir eine PCR-basierte Technik, um einzelne Fliegen zu genotypisieren, indem wir ein kleines Segment ihres Mittelbeins analysieren. Fliegen, die die Screening-Kriterien bestehen, werden dann verwendet, um stabile Bestände zu produzieren. Hier beschreiben wir das Design und den Bau von CRISPR-Editing-Plasmiden und Methoden zum Screening und zur Bestätigung von technischen Linien. Zusammen verbessert dieses Protokoll die Effizienz der endogenen Genmarkierung in Drosophila erheblich und ermöglicht die Untersuchung zellulärer Prozesse in vivo.
Introduction
Fluoreszierende Proteine haben sich als leistungsfähige Werkzeuge zur Visualisierung von Proteinlokalisierung, Dynamik und Protein-Protein-Wechselwirkungen in Zellen in lebenden Organismen erwiesen 1,2. Die Markierung endogener Gene mit fluoreszierenden Proteinen ermöglicht die Langzeit-Live-Bildgebung zellulärer Prozesse mit subzellulärer Auflösung. Darüber hinaus haben diese endogenen Genmarkierungstechniken mehrere Vorteile gegenüber Überexpressions- und Immunfärbeansätzen. Beispielsweise kann eine Überexpression von Proteinen zu Proteinfehlfaltung, unspezifischen Protein-Protein-Wechselwirkungen und Fehllokalisierung führen3. Bisher konnten Forscher umfangreiche Bibliotheken endogener Gene erstellen, die mit fluoreszierenden Proteinen für einige Modellorganismen fusioniert sind, wie z. B. knospende Hefe, die eine effiziente homologe Rekombination durchlaufen können4. Im Fall von Drosophila melanogaster wurden verschiedene Werkzeuge wie MiMICs5, Transposon-basierte Enhancer-Fallen6 und Fosmide7 entwickelt, um Gene fluoreszierend zu markieren.
Die Entwicklung von CRISPR-Cas9-basierten Werkzeugen hat es ermöglicht, Genome Editing, einschließlich der Markierung endogener Proteine, in einer Vielzahl von Modellorganismen effizient durchzuführen 8,9. Cas9 ist ein RNA-gesteuertes Enzym, das doppelsträngige DNA auf hocheffiziente und spezifische Weise spaltet8, die dann durch einen nicht-homologen Endverbindungsweg (NHEJ) repariert werden kann, der zu Punktmutationen oder Deletionen führt. Alternativ ermöglicht der homologiegesteuerte Reparaturweg (HDR) die Integration heterologer DNA in das Chromosom.
Bisherige Methoden zur CRISPR-basierten Genmarkierung im Modellorganismus Drosophila melanogaster beruhten auf einem zweistufigen Prozess 10,11,12. Dazu wird ein erkennbarer Augenfarbenmarker, Dsred, verwendet, um erfolgreiche HDR-Ereignisse zu erkennen. Anschließend würde der Dsred-Marker mit dem Cre/loxP-Rekombinationssystem herausgeschnitten. Um diesen Prozess zu rationalisieren und zu beschleunigen, stellen wir Ihnen hier eine einfachere und effizientere Methode vor. Dieser Ansatz umgeht die Notwendigkeit einer tödlichen Genotypisierung und ermöglicht das direkte Screening einzelner Fliegen. Insbesondere verwenden wir einen PCR-basierten Ansatz, um DNA aus einem kleinen Segment des Mittelbeins der Fliege zu extrahieren, was es uns ermöglicht, einzelne Fliegen zu genotypisieren. Bemerkenswert ist, dass dieses Verfahren die Vitalität, Bewegung oder Fortpflanzungsfähigkeit der beprobten Fliege nicht beeinträchtigt. Nur die geeigneten Individuen, die durch diese Methode identifiziert werden, werden zu stabilen Beständen weiterentwickelt.
Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Erzeugung von fluoreszierenden Protein-markierten Fliegen vor, in denen endogene Gene mit fluoreszierenden Reportern markiert sind. Diese Technik verwendet CRISPR-Cas9-Genom-Editierung, um jede gewünschte Fluorophormarkierung mit dem N- oder C-Terminus eines endogenen Gens zu fusionieren. Im Folgenden beschreiben wir das Design und die Konstruktion von gRNA-Plasmiden und eines Spenderplasmids, die einstufige Screening-Strategie zur Auswahl von CRISPR-positiven Fliegen und die Schritte zur Etablierung stabiler Linien. Insbesondere beschreiben wir Strategien, um ein endogenes Drosophila-Gen mit einem Fluorophor am C-Terminal zu markieren. Wir beschreiben auch kurz die Kontrollexperimente, die durchgeführt werden müssen, um zu bestätigen, dass das markierte Protein funktionsfähig ist, und Live-Imaging-Techniken zur Visualisierung des Periodenproteins in lebenden Uhrenneuronen in intakten Drosophila-Gehirnen 13. Das hier beschriebene Protokoll ist auch allgemein anwendbar, um Kandidaten auf Deletionen und Insertionen bestimmter DNA-Bits durch CRISPR-Cas9-Genom-Editierung zu untersuchen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Ergebnisse zeigen eine schlanke, einfache, einstufige CRISPR-basierte Strategie zur Markierung endogener Gene in Drosophila. In dem Protokoll verwenden wir zwei gRNAs, um DNA-Doppelstrangbruch und homologe Rekombination effizienter zu induzieren. Die gRNAs und das Spenderplasmid werden in Fruchtfliegenembryonen injiziert, die in ihrer Keimbahn das Cas9-Enzym exprimieren. Diese Embryonen werden anschließend unter Standardbedingungen bis zum Erwachsenenalter kultiviert, dann werden sie mit Balancierfliegen ge…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken George Watase und Josie Clowney für die Diskussionen in der Anfangsphase der Protokollentwicklung. Die Arbeit wurde durch Mittel des NIH (Zuschuss Nr. R35GM133737 an S.Y.), Alfred P. Sloan Fellowship (an S. Y.) und McKnight Scholar Award (an S. Y.) unterstützt.
Materials
| 0.5M EDTA pH8.0 | Invitrogen | AM9260G | |
| 5-alpha Competent E. coli (High Efficiency) | NEB | C2987H | |
| 96-well deep well plate | BRAND | 701354 | |
| Agar | Fisher Scientific | BP1423-500 | |
| BbsI-HF | NEB | R3539S | |
| DreamTaq Green PCR Master Mix (2X) | Thermo Scientific | K1081 | |
| D-Sucrose | Fisher Scientific | BP220-1 | |
| EcoRI-HF | NEB | R3101S | |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A142-212 | |
| Prolong Glass Antifade Mounting Medium | Invitrogen | P36982 | |
| Proteinase K | QIAGEN | 19131 | |
| Schneider's Drosophila Medium | Gibco | 21720001 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-500 | |
| T4 DNA ligase | NEB | M0202S | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-500 | |
| XbaI | NEB | R0145S |
Riferimenti
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