Stratégie basée sur CRISPR en une étape pour le marquage des gènes endogènes chez Drosophila melanogaster
Summary
Ici, nous présentons un protocole simplifié de marquage génétique endogène pour la drosophile, qui utilise une technique basée sur la PCR pour l’identification sans marqueur des modifications génétiques réussies, facilitant le développement de lignées d’inclusion stables.
Abstract
L’étude de la localisation, de la dynamique et de la régulation subcellulaires des protéines dans les cellules vivantes a été profondément transformée par l’avènement de techniques permettant le marquage de gènes endogènes pour produire des protéines de fusion fluorescentes. Ces méthodes permettent aux chercheurs de visualiser le comportement des protéines en temps réel, fournissant des informations précieuses sur leurs fonctions et leurs interactions dans l’environnement cellulaire. De nombreuses études actuelles sur le marquage génétique utilisent un processus en deux étapes où les marqueurs visibles, tels que les changements de couleur des yeux, sont utilisés pour identifier les organismes génétiquement modifiés dans la première étape, et le marqueur visible est excisé dans la deuxième étape. Ici, nous présentons un protocole en une étape pour effectuer un marquage génétique endogène précis et rapide chez Drosophila melanogaster, qui permet de dépister des lignées modifiées sans marqueur oculaire visible, offrant un avantage significatif par rapport aux méthodes précédentes. Pour dépister les événements de marquage génétique réussis, nous utilisons une technique basée sur la PCR pour génotyper des mouches individuelles en analysant un petit segment de leur patte médiane. Les mouches qui répondent aux critères de sélection sont ensuite utilisées pour produire des stocks stables. Ici, nous détaillons la conception et la construction des plasmides d’édition CRISPR et les méthodes de criblage et de confirmation des lignées modifiées. Ensemble, ce protocole améliore considérablement l’efficacité du marquage génétique endogène chez la drosophile et permet d’étudier les processus cellulaires in vivo.
Introduction
Les protéines fluorescentes sont devenues des outils puissants pour visualiser la localisation des protéines, la dynamique et les interactions protéine-protéine dans les cellules des organismes vivants 1,2. Le marquage des gènes endogènes avec des protéines fluorescentes permet d’imager en direct à long terme les processus cellulaires avec une résolution subcellulaire. De plus, ces techniques de marquage de gènes endogènes présentent plusieurs avantages par rapport aux approches de surexpression et d’immunomarquage. Par exemple, la surexpression des protéines peut entraîner un mauvais repliement des protéines, des interactions protéine-protéine non spécifiques et une mauvaise localisation3. À ce jour, les chercheurs ont pu créer de vastes bibliothèques de gènes endogènes fusionnés à des protéines fluorescentes pour quelques organismes modèles, tels que la levure bourgeonnante, qui peuvent subir une recombinaison homologue efficace4. Dans le cas de Drosophila melanogaster, divers outils tels que MiMICs5, les pièges amplificateurs à base de transposons6 et les fosmids7 ont été conçus pour marquer les gènes par fluorescence.
Le développement d’outils basés sur CRISPR-Cas9 a permis d’effectuer efficacement l’édition du génome, y compris le marquage des protéines endogènes, dans un large éventail d’organismes modèles 8,9. Cas9 est une enzyme guidée par l’ARN qui clive l’ADN double brin d’une manière très efficace et spécifique8, qui peut ensuite être réparée par une voie de jonction d’extrémité non homologue (NHEJ) conduisant à des mutations ponctuelles ou à des délétions ponctuelles. Alternativement, la voie de réparation dirigée par homologie (HDR) permet l’intégration de l’ADN hétérologue dans le chromosome.
Les méthodes antérieures de marquage génique basé sur CRISPR dans l’organisme modèle, Drosophila melanogaster, reposaient sur un processus en deux étapes 10,11,12. Cela implique l’utilisation d’un marqueur de couleur des yeux discernable, Dsred, pour détecter les événements HDR réussis. Ensuite, le marqueur Dsred serait excisé à l’aide du système de recombinaison Cre/loxP. Pour rationaliser et accélérer ce processus, nous vous présentons ici une méthode plus simple et plus efficace. Cette approche contourne le besoin de génotypage létal et permet le dépistage direct des mouches individuelles. Plus précisément, nous utilisons une approche basée sur la PCR pour extraire l’ADN d’un petit segment de la patte médiane de la mouche, ce qui nous permet de génotyper des mouches individuelles. Notamment, cette procédure ne compromet pas la vitalité, le mouvement ou les capacités de reproduction de la mouche échantillonnée. Seuls les individus appropriés, identifiés par cette méthode, sont développés en stocks stables.
Nous présentons ici un protocole détaillé pour générer des mouches marquées par des protéines fluorescentes dans lesquelles les gènes endogènes sont marqués avec des rapporteurs fluorescents. Cette technique utilise l’édition du génome CRISPR-Cas9 pour fusionner n’importe quelle étiquette fluorophore souhaitée à la terminaison N ou C d’un gène endogène. Ci-dessous, nous décrivons la conception et la construction de plasmides d’ARNg et d’un plasmide donneur, la stratégie de criblage en une étape pour sélectionner les mouches positives à CRISPR et les étapes pour établir des lignées stables. Plus précisément, nous décrivons des stratégies pour marquer un gène endogène de la drosophile, point final, avec un fluorophore à l’extrémité C-terminale. Nous décrivons également brièvement les expériences de contrôle qui doivent être effectuées pour confirmer que la protéine marquée est fonctionnelle et les techniques d’imagerie en direct pour visualiser la protéine Period dans les neurones de l’horloge vivante dans les cerveaux intacts de la drosophile 13. Le protocole décrit ici est également largement applicable au criblage des candidats pour les délétions et les insertions de morceaux d’ADN spécifiques par édition du génome CRISPR-Cas9.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les résultats démontrent une stratégie simplifiée et simple basée sur CRISPR en une étape pour marquer les gènes endogènes chez la drosophile. Dans le protocole, nous utilisons deux ARNg pour induire plus efficacement la cassure double brin de l’ADN et la recombinaison homologue. Les ARNg et le plasmide donneur sont injectés dans des embryons de mouches des fruits, qui expriment l’enzyme Cas9 dans leur lignée germinale. Ces embryons sont ensuite cultivés dans des conditions standard jusqu’à l?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions George Watase et Josie Clowney pour les discussions qui ont eu lieu au cours des premières étapes de l’élaboration du protocole. Le travail a été soutenu par des fonds du NIH (subvention n° R35GM133737 à S.Y.), de la bourse Alfred P. Sloan (à S. Y.) et du McKnight Scholar Award (à S. Y.).
Materials
| 0.5M EDTA pH8.0 | Invitrogen | AM9260G | |
| 5-alpha Competent E. coli (High Efficiency) | NEB | C2987H | |
| 96-well deep well plate | BRAND | 701354 | |
| Agar | Fisher Scientific | BP1423-500 | |
| BbsI-HF | NEB | R3539S | |
| DreamTaq Green PCR Master Mix (2X) | Thermo Scientific | K1081 | |
| D-Sucrose | Fisher Scientific | BP220-1 | |
| EcoRI-HF | NEB | R3101S | |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A142-212 | |
| Prolong Glass Antifade Mounting Medium | Invitrogen | P36982 | |
| Proteinase K | QIAGEN | 19131 | |
| Schneider's Drosophila Medium | Gibco | 21720001 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-500 | |
| T4 DNA ligase | NEB | M0202S | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-500 | |
| XbaI | NEB | R0145S |
Riferimenti
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