Summary
यहां, हम ड्रोसोफिला के लिए एक सरलीकृत अंतर्जात जीन टैगिंग प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं, जो सफल आनुवंशिक संशोधनों की मार्कर-मुक्त पहचान के लिए पीसीआर-आधारित तकनीक का उपयोग करता है, जिससे स्थिर नॉक-इन लाइनों के विकास की सुविधा मिलती है।
Abstract
प्रोटीन उपकोशिकीय स्थानीयकरण, गतिशीलता, और जीवित कोशिकाओं में विनियमन का अध्ययन गहराई से तकनीक है कि अंतर्जात जीन के टैगिंग फ्लोरोसेंट संलयन प्रोटीन का उत्पादन करने के लिए अनुमति के आगमन से बदल दिया गया है. ये विधियां शोधकर्ताओं को वास्तविक समय में प्रोटीन व्यवहार की कल्पना करने में सक्षम बनाती हैं, जिससे सेलुलर वातावरण के भीतर उनके कार्यों और इंटरैक्शन में मूल्यवान अंतर्दृष्टि मिलती है। कई वर्तमान जीन टैगिंग अध्ययन दो-चरणीय प्रक्रिया को नियोजित करते हैं जहां दृश्यमान मार्कर, जैसे कि आंखों के रंग में परिवर्तन, का उपयोग पहले चरण में आनुवंशिक रूप से संशोधित जीवों की पहचान करने के लिए किया जाता है, और दृश्यमान मार्कर को दूसरे चरण में निकाला जाता है। यहां, हम ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर में सटीक और तेजी से अंतर्जात जीन टैगिंग करने के लिए एक-चरण प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं, जो पिछले तरीकों पर महत्वपूर्ण लाभ प्रदान करते हुए, दृश्यमान आंख मार्कर के बिना इंजीनियर लाइनों के लिए स्क्रीनिंग को सक्षम बनाता है। सफल जीन-टैगिंग घटनाओं के लिए स्क्रीन करने के लिए, हम अपने मध्य पैर से एक छोटे से खंड का विश्लेषण करके व्यक्तिगत मक्खियों को जीनोटाइप करने के लिए एक पीसीआर-आधारित तकनीक का उपयोग करते हैं। स्क्रीनिंग मानदंडों को पार करने वाली मक्खियों का उपयोग स्थिर स्टॉक का उत्पादन करने के लिए किया जाता है। यहां, हम सीआरआईएसपीआर संपादन प्लास्मिड के डिजाइन और निर्माण और इंजीनियर लाइनों की स्क्रीनिंग और पुष्टि के तरीकों का विस्तार करते हैं। साथ में, यह प्रोटोकॉल ड्रोसोफिला में अंतर्जात जीन टैगिंग की दक्षता में काफी सुधार करता है और विवो में सेलुलर प्रक्रियाओं के अध्ययन को सक्षम बनाता है।
Introduction
फ्लोरोसेंट प्रोटीन जीवित जीवों 1,2 के भीतर कोशिकाओं में प्रोटीन स्थानीयकरण, गतिशीलता, और प्रोटीन प्रोटीन बातचीत visualizing के लिए शक्तिशाली उपकरण के रूप में उभरा है. फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ अंतर्जात जीन टैगिंग उपकोशिकीय संकल्प के साथ सेलुलर प्रक्रियाओं की दीर्घकालिक लाइव इमेजिंग सक्षम बनाता है। इसके अलावा, इन अंतर्जात जीन-लेबलिंग तकनीकों में अतिअभिव्यक्ति और इम्यूनोस्टेनिंग दृष्टिकोण की तुलना में कई फायदे हैं। उदाहरण के लिए, प्रोटीन की overexpression प्रोटीन misfolding, निरर्थक प्रोटीन प्रोटीन बातचीत, और mislocalization3 के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. तिथि करने के लिए, शोधकर्ताओं इस तरह के नवोदित खमीर, जो कुशल homologous पुनर्संयोजन4 से गुजरना कर सकते हैं के रूप में कुछ मॉडल जीवों, के लिए फ्लोरोसेंट प्रोटीन से जुड़े अंतर्जात जीन के विशाल पुस्तकालयों का निर्माण करने में सक्षम किया गया है. ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर के मामले में, एमआईएमआईसी5, ट्रांसपोसॉन-आधारित एन्हांसर ट्रैप6, और फॉस्मिड्स7 जैसे विभिन्न उपकरण जीन को फ्लोरोसेंटली टैग करने के लिए तैयार किए गए हैं।
सीआरआईएसपीआर-कैस 9-आधारित उपकरणों के विकास ने मॉडल जीव 8,9 की एक विस्तृत श्रृंखला में अंतर्जात प्रोटीन को टैग करने सहित जीनोम संपादन को कुशलतापूर्वक करना संभव बना दिया है। Cas9 एक आरएनए-निर्देशित एंजाइम है जो अत्यधिक कुशल और विशिष्ट तरीके से डबल-फंसे डीएनए को क्लीवेज करता है8, जिसे तब एक गैर-समरूप अंत-जुड़ने (NHEJ) मार्ग द्वारा मरम्मत की जा सकती है जिससे बिंदु उत्परिवर्तन या विलोपन होता है। वैकल्पिक रूप से, होमोलॉजी-निर्देशित मरम्मत (एचडीआर) मार्ग गुणसूत्र में विषम डीएनए के एकीकरण की अनुमति देता है।
मॉडल जीव में सीआरआईएसपीआर आधारित जीन टैगिंग के लिए पिछले विधियों, ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर, एक दो कदम प्रक्रिया10,11,12पर भरोसा किया है. इसमें सफल एचडीआर घटनाओं का पता लगाने के लिए एक स्पष्ट आंखों के रंग मार्कर, डीएसरेड का उपयोग करना शामिल है। बाद में, Dsred मार्कर को Cre/loxP पुनर्संयोजन प्रणाली का उपयोग करके निकाला जाएगा। इस प्रक्रिया को सुव्यवस्थित और तेज करने के लिए, यहां, हम एक सरल और अधिक कुशल तरीका प्रस्तुत करते हैं। यह दृष्टिकोण घातक जीनोटाइपिंग की आवश्यकता को दरकिनार करता है और व्यक्तिगत मक्खियों की प्रत्यक्ष जांच की अनुमति देता है। विशेष रूप से, हम मक्खी के मध्य पैर के एक छोटे से खंड से डीएनए निकालने के लिए एक पीसीआर आधारित दृष्टिकोण को रोजगार, हमें व्यक्तिगत मक्खियों जीनोटाइप करने के लिए अनुमति देता है. विशेष रूप से, यह प्रक्रिया नमूना मक्खी की जीवन शक्ति, आंदोलन या प्रजनन क्षमताओं से समझौता नहीं करती है। इस पद्धति के माध्यम से पहचाने जाने वाले केवल उपयुक्त व्यक्तियों को ही स्थिर स्टॉक में विकसित किया जाता है।
यहां, हम फ्लोरोसेंट प्रोटीन टैग मक्खियों को उत्पन्न करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं जिसमें अंतर्जात जीन फ्लोरोसेंट पत्रकारों के साथ लेबल किए जाते हैं। यह तकनीक किसी भी वांछित फ्लोरोफोर टैग को एक अंतर्जात जीन के एन- या सी-टर्मिनल में फ्यूज करने के लिए सीआरआईएसपीआर-कैस 9 जीनोम संपादन का उपयोग करती है। नीचे, हम जीआरएनए प्लास्मिड और एक दाता प्लास्मिड के डिजाइन और निर्माण का वर्णन करते हैं, सीआरआईएसपीआर-पॉजिटिव मक्खियों का चयन करने के लिए एक-चरण स्क्रीनिंग रणनीति, और स्थिर लाइनों को स्थापित करने के लिए कदम। विशेष रूप से, हम सी-टर्मिनल पर फ्लोरोफोर के साथ एक अंतर्जात कोर घड़ी ड्रोसोफिला जीन, अवधि को टैग करने के लिए रणनीतियों का वर्णन करते हैं। हम भी संक्षेप में नियंत्रण प्रयोगों है कि टैग प्रोटीन कार्यात्मक और जिंदा इमेजिंग तकनीक बरकरार ड्रोसोफिला दिमाग13 के भीतर रहते घड़ी न्यूरॉन्स में अवधि प्रोटीन कल्पना करने के लिए पुष्टि करने के लिए प्रदर्शन किया जा करने की आवश्यकता का वर्णन. यहां वर्णित प्रोटोकॉल सीआरआईएसपीआर-कैस 9 जीनोम संपादन द्वारा डीएनए के विशिष्ट बिट्स के विलोपन और सम्मिलन के लिए स्क्रीन उम्मीदवारों पर भी व्यापक रूप से लागू होता है।
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Protocol
1. जीन संपादन अभिकर्मकों का डिजाइन और निर्माण
नोट: अंतर्जात टैगिंग करने के लिए, वांछित जीन के विभिन्न आइसोफॉर्म की पहचान करना आवश्यक है। प्रयोग के विशिष्ट लक्ष्यों के आधार पर, एक फ्लोरोसेंट टैग को आंतरिक रूप से या चयनित प्रोटीन आइसोफॉर्म (ओं) के एन- या सी-टर्मिनी पर शामिल किया जा सकता है। इष्टतम सीआरआईएसपीआर-मध्यस्थता संपादन के लिए, दो एसजीआरएनए को उपयुक्त रूप से इच्छित नॉक-इन साइट के करीब रखना महत्वपूर्ण है। इसके बाद, समरूप पुनर्संयोजन के माध्यम से संपादन को सक्षम करने के लिए, फ्लोरोसेंट टैग के साथ, लक्ष्य जीन के लिए समरूप अनुक्रमों को शामिल करने वाला एक दाता वेक्टर तैयार किया जाना चाहिए। नीचे इन प्रक्रियाओं (चित्रा 1) के लिए एक कदम दर कदम गाइड है.
- नीचे वर्णित के रूप में डिजाइन एसजीआरएनए
- इन वेबसाइटों का उपयोग करके ड्रोसोफिला के लिए एसजीआरएनए डिजाइन करें: http://tools.flycrispr.molbio.wisc.edu/targetFinder/ या http://www.flyrnai.org/crispr2/।
- फ्लाईक्रिस्पर वेबसाइट के लिए, वांछित नॉक-इन स्थान (एन टर्मिनल, सी टर्मिनल, या ब्याज के किसी भी जीनोमिक लोकस) के आसपास अनुक्रम ±100 बीपी दर्ज करें। यदि इंजेक्शन पृष्ठभूमि के रूप में nos-Cas9 attP2 का उपयोग कर रहे हैं, तो जीनोम विकल्प ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर (nos-Cas9 III, BDSC #78782) चुनें। Nos-Cas9 प्रणाली जर्मलाइन-विशिष्ट Cas9 अभिव्यक्ति सुनिश्चित करती है।
- एसजीआरएनए अभिव्यक्ति दक्षता में सुधार करने के लिए, 5 'जी विकल्प के साथ सीआरआईएसपीआर लक्ष्यों का चयन करें, क्योंकि एसजीआरएनए जो एक गुआनिन के साथ शुरू होते हैं, संपादन गतिविधि को बढ़ाएंगे। फिर, क्लिक करें सीआरआईएसपीआर लक्ष्य खोजें बटन। संभावित एसजीआरएनए अनुक्रमों की एक सूची प्रदर्शित की जाएगी।
- प्रत्येक अनुक्रम के लिए, मूल्यांकन बटन पर क्लिक करें। यह क्रिया पहले से चयनित जीनोम के आधार पर प्रत्येक अनुक्रम के लिए किसी भी संभावित लक्ष्य की जांच करती है। प्रदान की गई सूची से, 2 एसजीआरएनए चुनें जिनमें 0 ऑफ टारगेट हैं। सुनिश्चित करें कि एक एसजीआरएनए अपस्ट्रीम है और दूसरा नॉक-इन स्थान के सापेक्ष डाउनस्ट्रीम है। आदर्श रूप से, उनकी स्थिति यथासंभव नॉक-इन साइट के पास होनी चाहिए (<200 बीपी), लेकिन उन्हें एक दूसरे के साथ ओवरलैप नहीं करना चाहिए (चित्र 2)।
नोट: कभी-कभी किसी दिए गए लक्ष्य जीन के लिए उपयुक्त एसजीआरएनए ढूंढना मुश्किल हो सकता है। एसजीआरएनए और नॉक-इन स्थान के बीच के अंतर को ± 200 बीपी तक बढ़ाया जा सकता है। जी के साथ शुरू नहीं करने वाले एसजीआरएनए का उपयोग सकारात्मक दर को थोड़ा कम कर सकता है।
- नीचे वर्णित के रूप में फ्लोरोसेंट टैग चयन करें.
- फ्लोरोसेंट टैग विशेषताओं की एक विविध श्रेणी प्रदान करते हैं, प्रत्येक के अपने अद्वितीय फायदे और कमियां 1,2 हैं। एक विशिष्ट प्रोटीन लेबलिंग के लिए आदर्श फ्लोरोसेंट टैग का निर्धारण करते समय, खेलने में आने वाले निम्नलिखित चरणों में वर्णित महत्वपूर्ण विचारों का ध्यान रखें।
- यह देखते हुए कि प्राकृतिक प्रोटीन अभिव्यक्ति का स्तर आम तौर पर अतिअभिव्यक्ति प्रयोगों 1,2 में देखा उन लोगों की तुलना में बहुत कम कर रहे हैं, टैग है कि उज्ज्वल और phototable हैं और कि प्रयोगात्मक सेटअप फिट के साथ शुरू. कुछ फ्लोरोसेंट टैग, विशेष रूप से कुछ आरएफपी जैसे tdTomato और DsRed, मल्टीमर्स14 बनाते हैं और प्रोटीन एकत्रीकरण का कारण बन सकते हैं।
- बढ़ी हुई बहुमुखी प्रतिभा के लिए, एपिटोप टैग (जैसे, फ्लैग या वी 5) को एक लचीले लिंकर का उपयोग करके फ्लोरोसेंट मार्कर से लिंक करें, जो वेस्टर्न ब्लॉट या सह-इम्यूनोप्रिपिटेशन जैसे जैव रासायनिक विश्लेषण की अनुमति देता है।
- लिंकर डिजाइन के लिए, नीचे वर्णित चरणों का पालन करें।
- इष्टतम कार्यक्षमता के लिए, सुनिश्चित करें कि ब्याज की अंतर्जात प्रोटीन और फ्लोरोसेंट टैग दोनों अपने संबंधित कार्यात्मक रूपों में अलग-अलग गुना हैं। इसे प्राप्त करने के लिए, लंबाई में 2-20 अमीनो एसिड से लेकर लिंकर पेप्टाइड का उपयोग करें। उदाहरण के लिए, अवधि प्रोटीन के अंतिम अमीनो एसिड और नॉक-इन फ्लोरोसेंट प्रोटीन mNeonGreen के पहले अमीनो एसिड के बीच दो ग्लाइसिन अवशेष रखें।
- सुनिश्चित करें कि इन लिंकर पेप्टाइड दृश्यों में ग्लाइसिन और सेरीन जैसे अमीनो एसिड शामिल हैं, जो संरचना15 को लचीलापन प्रदान करते हैं। यह सुनिश्चित करता है कि अंतर्जात प्रोटीन का प्राकृतिक व्यवहार और स्थान अपरिवर्तित रहे।
- नीचे वर्णित के रूप में डिजाइन दाता वेक्टर।
नोट: दाता वेक्टर होमोलॉजी-निर्देशित मरम्मत की प्रक्रिया के माध्यम से वांछित अंतर्जात स्थान पर फ्लोरोसेंट टैग का परिचय देता है, जिसे सीआरआईएसपीआर दरार द्वारा शुरू किया जाता है। जैसे, फ्लोरोसेंट टैग के अलावा, दाता वेक्टर के पास ऐसे अनुक्रम होने चाहिए जो टैग के दोनों किनारों पर समरूप हों।- लिंकर पेप्टाइड और फ्लोरोसेंट टैग के डीएनए अनुक्रम का आयोजन करके दाता वेक्टर डिजाइन शुरू करें और सुनिश्चित करें कि दोनों सिरों (होमोलॉजी हथियार) को फ़्लैंक करने वाले समरूप अनुक्रम हैं। इष्टतम परिणामों के लिए, होमोलॉजी हथियारों का इरादा नॉक-इन साइट (चित्रा 2) के प्रत्येक तरफ कम से कम 800 न्यूक्लियोटाइड शामिल हैं।
नोट: हाल की रिपोर्टों से पता चलता है कि होमोलॉजी हथियार कम (100-200 बीपी)16हो सकते हैं। - सुनिश्चित करें कि दाता प्लाज्मिड के भीतर किसी भी पीएएम दृश्यों को इस तरह से संशोधित किया जाता है कि परिणामस्वरूप प्रोटीन का अमीनो एसिड अनुक्रम अपरिवर्तित रहता है। यदि पीएएम अनुक्रम यूटीआर में स्थित है, तो इसे पूरी तरह से हटा दें।
- START और STOP कोडन की स्थिति टैग के स्थान पर निर्भर करती है। आंतरिक टैगिंग के लिए, सुनिश्चित करें कि फ्लोरोसेंट टैग लक्ष्य जीन के कोडिंग अनुक्रम के साथ फ्रेम में है। एन-टर्मिनस टैगिंग के लिए, अंतर्जात प्रारंभ कोडन से पहले फ्लोरोसेंट टैग की स्थिति बनाएं। सी-टर्मिनस टैगिंग के लिए, प्राकृतिक स्टॉप कोडन से पहले फ्लोरोसेंट टैग को स्थित करें और संभावित अनुवाद मुद्दों से बचने के लिए केवल एक स्टार्ट कोडन को बनाए रखना सुनिश्चित करें।
- लिंकर पेप्टाइड और फ्लोरोसेंट टैग के डीएनए अनुक्रम का आयोजन करके दाता वेक्टर डिजाइन शुरू करें और सुनिश्चित करें कि दोनों सिरों (होमोलॉजी हथियार) को फ़्लैंक करने वाले समरूप अनुक्रम हैं। इष्टतम परिणामों के लिए, होमोलॉजी हथियारों का इरादा नॉक-इन साइट (चित्रा 2) के प्रत्येक तरफ कम से कम 800 न्यूक्लियोटाइड शामिल हैं।
- नीचे वर्णित के रूप में एसजीआरएनए और दाता प्लास्मिड को संश्लेषित करें।
- एसजीआरएनए प्लास्मिड निर्माण के लिए, यू 6-जीआरएनए क्लोनिंग दिशानिर्देशों का पालन करें, जो flycrispr.org/protocols/grna/ पर पाया जा सकता है। वैकल्पिक प्रतिबंध एंजाइम-आधारित क्लोनिंग दृष्टिकोण (प्रदान किए गए संसाधन में रणनीति सी के रूप में संदर्भित) को pU6-BbsI-chiRNA प्लास्मिड (Addgene, #45946) में जीआरएनए अनुक्रम डालने के लिए नियोजित करें।
- DH5a E में रूपांतरण। कोलाई (NEB, C2987H) निर्माता द्वारा प्रदान किए गए मानक परिवर्तन प्रोटोकॉल का पालन करना। सत्यापन के लिए, टी 3 या टी 7 मानक अनुक्रमण प्राइमरों का उपयोग कर जिसके परिणामस्वरूप क्लोन पर सेंगर अनुक्रमण का आचरण.
- दाता प्लास्मिड के निर्माण के लिए, वाणिज्यिक आपूर्तिकर्ताओं (जैसे, आईडीटी) से वांछित दाता अनुक्रम के साथ डबल-फंसे डीएनए प्राप्त करें। इसे pBlueScriptII SK(-) एकाधिक क्लोनिंग साइट में एकीकृत करें। दाता प्लास्मिड अनुक्रम सुनिश्चित करने के लिए एसजीआरएनए या पीएएम अनुक्रमों को सही ढंग से संशोधित किया गया है और प्लास्मिड में मौजूद कोई एसएनपी नहीं हैं।
नोट: pBlueScriptII का उपयोग करके एकीकरण का एक विकल्प होमोलॉजी हथियारों और फ्लोरोसेंट टैग सेगमेंट को अलग-अलग पीसीआर करना है और गोल्डन गेट असेंबली या गिब्सन असेंबली जैसी तकनीकों का उपयोग करके उन्हें रीढ़ की हड्डी में समेकित करना है।
- निम्नलिखित इंजेक्शन और क्रॉसिंग योजना का उपयोग करें।
- जर्मलाइन-संपादित मक्खियों को प्राप्त करने के लिए, जीआरएनए प्लास्मिड और दाता प्लास्मिड को उपयुक्त कैस 9 पृष्ठभूमि (जैसे, एनओएस-कैस 9 III, बीडीएससी 78782) में सह-इंजेक्ट करें। यदि वाणिज्यिक इंजेक्शन सेवाओं का उपयोग कर रहे हैं, तो प्लास्मिड तैयारी करने के लिए विक्रेता के निर्देशों का पालन करें।
नोट: आमतौर पर, जीआरएनए प्लास्मिड एकाग्रता 0.5 माइक्रोग्राम/जेडएल से अधिक होनी चाहिए, और दाता प्लास्मिड एकाग्रता 1.0 माइक्रोग्राम/जेडएल से ऊपर होनी चाहिए। इंजेक्शन भ्रूण प्राप्त करने के लिए प्लास्मिड नमूने बाहर भेजने से एक आम समय लगभग 2 सप्ताह है. एल बैलेंसर स्ट्रेन को नियोजित करने वाले एक्स गुणसूत्र पर जीन संपादन घटनाओं के लिए स्क्रीन करने की रणनीति यहां प्रस्तुत की गई है। दूसरे या तीसरे गुणसूत्र पर जीन के लिए, उपयुक्त बैलेंसर उपभेदों को नियोजित करें। - इंजेक्शन मक्खियों (G0) के संग्रह के लिए, कार्बन डाइऑक्साइड के साथ संवेदनाहारी करें और नर मक्खियों और कुंवारी मादाओं को अलग करें। प्रत्येक G0 पुरुष को व्यक्तिगत संकीर्ण CT खाद्य शीशियों में कम से कम दो FM7/L कुंवारी महिलाओं के साथ जोड़कर फ्लाई क्रॉस स्थापित करें। 25 डिग्री सेल्सियस और ~ 60% आर्द्रता पर बनाए गए एक वेंटेड इनक्यूबेटर में पार की गई शीशियों को रखें जब तक कि एफ 1 मक्खियों के करीब न हो जाए (एफएम 7/एल सबसे अधिक इस्तेमाल किया जाने वाला एक्स क्रोमोसोम बैलेंसर है)। इसी तरह, प्रत्येक G0 महिला को FM7/Y नर मक्खियों के साथ पेयर करें।
- G0 नर और मादा क्रॉस दोनों से कम से कम 10 कुंवारी महिला संतानों (F1) को एनेस्थेटाइज करें और इकट्ठा करें। G0 महिला पार से, कम से कम 10 पुरुष F1 मक्खियों (चित्रा 3A) इकट्ठा. सुनिश्चित करें कि प्रत्येक F1 फ्लाई को उसके माता-पिता के विवरण के साथ टैग किया गया है और अलग से संग्रहीत किया गया है। स्क्रीनिंग चरण के लिए आगे बढ़ें।
- जर्मलाइन-संपादित मक्खियों को प्राप्त करने के लिए, जीआरएनए प्लास्मिड और दाता प्लास्मिड को उपयुक्त कैस 9 पृष्ठभूमि (जैसे, एनओएस-कैस 9 III, बीडीएससी 78782) में सह-इंजेक्ट करें। यदि वाणिज्यिक इंजेक्शन सेवाओं का उपयोग कर रहे हैं, तो प्लास्मिड तैयारी करने के लिए विक्रेता के निर्देशों का पालन करें।
- निम्न सिंगल-लेग PCR प्रोटोकॉल का उपयोग करें।
- प्राइमर निर्माण: लक्ष्य जीन के संपादन स्थल को शामिल करते हुए एक प्राइमर जोड़ी डिज़ाइन करें। आदर्श रूप से, प्राइमरों का पिघलने का तापमान समान होना चाहिए, लगभग 55 डिग्री सेल्सियस।
- Lysis बफर तैयारी: हर मक्खी नमूना के लिए lysis बफर के 10 माइक्रोन तैयार करें. बफर में 10 एमएम ट्रिस (पीएच 8.2), 1 एमएम ईडीटीए (पीएच 8.0), 25 एमएम एनएसीएल, और 400 माइक्रोग्राम/एमएल प्रोटीनेज के होते हैं। एक मास्टर मिश्रण के रूप में लाइसिस बफर तैयार करें, फिर 96-अच्छी तरह से पीसीआर प्लेट के प्रत्येक कुएं में 10 माइक्रोन वितरित करें। सुनिश्चित करें कि बफर पैर विच्छेदन प्रक्रिया (चित्रा 3 बी) के दौरान ठंडा रहता है।
- ट्यूब सेटअप: ग्लास केशिका ट्यूब तैयार करें, सुक्रोज-अगर भोजन (2% अगर और 4% सुक्रोज) के साथ एक छोर भरना, और इन्हें 96-अच्छी तरह से गहरे कुएं की प्लेट में रखें, जिसे फ्लाई होटल(चित्रा 3सी)के रूप में संदर्भित किया जाएगा।
- पैर विच्छेदन: एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत कार्बन डाइऑक्साइड एनेस्थेटाइजेशन पैड रखें, एक उम्मीदवार मक्खी को संवेदनाहारी करें और मध्य पैरों में से एक को अलग करें। पैर को lysis बफर में रखें, पूर्ण विसर्जन सुनिश्चित करें। पैर को मैक्रट करना आवश्यक नहीं है, सीधे लाइसिस प्रोटोकॉल चरण(चित्रा 3बी)पर आगे बढ़ें। ठीक धातु संदंश की एक जोड़ी के साथ मक्खी विंग पकड़ो, मक्खी होटल के लिए मक्खी कदम, और तुरंत यार्न के साथ ट्यूब सील.
- नियंत्रण नमूने: दो जंगली प्रकार मक्खियों एक ही पैर विच्छेदन प्रक्रिया के बाद नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. एक पतला दाता प्लास्मिड सकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य करता है।
- विच्छेदन के बाद की देखभाल: 25 डिग्री सेल्सियस और ~ 60% आर्द्रता पर बनाए रखा एक वेंटेड इनक्यूबेटर में फ्लाई होटल को घर दें। जबकि मक्खियाँ रात भर जीवित रह सकती हैं, बाद के चरणों को पूरा करने और उसी दिन संभोग करने की सिफारिश की जाती है।
- लाइसिस प्रोटोकॉल: 90 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर थर्मोसाइक्लर सेट में लिसिस बफर समाधान में कटे हुए पैरों को रखें, इसके बाद 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस, अंत में 4 डिग्री सेल्सियस पर आयोजित किया जाता है। यह प्रत्येक मक्खी (चित्रा 3 बी) के एकल पैर से पर्याप्त डीएनए निकाल लेगा।
- पीसीआर प्रतिक्रिया: निर्माता द्वारा निर्देश के अनुसार पीसीआर प्रतिक्रिया को व्यवस्थित करें, डीएनए स्रोत के रूप में फ्लाई लेग लाइसेट के 1.5 माइक्रोन का उपयोग करें।
- जेल वैद्युतकणसंचलन: पीसीआर उत्पादों को अगारोज जेल वैद्युतकणसंचलन के अधीन करें। बैंड आकार के आधार पर जेल से परिणामों की व्याख्या करें। आमतौर पर, नकारात्मक नियंत्रण मक्खियों एक कम बैंड का प्रदर्शन करेंगे, और सकारात्मक प्लाज्मिड नियंत्रण एक उच्च बैंड प्रदर्शित करते हैं. सुनिश्चित करें कि विशिष्ट बैंड आकार मूल दाता प्लाज्मिड डिजाइन के अनुरूप हैं। महिला सकारात्मक मक्खियों दो बैंड प्रदर्शित करेगा के रूप में वे विषमयुग्मजी हैं, और पुरुष सकारात्मक एक एकल बैंड(चित्रा 3बी)पेश करेंगे.
नोट: आमतौर पर, एक ही दिन में 70 मक्खियों की स्क्रीनिंग प्राप्त की जा सकती है। 10 से 5 अलग-अलग G0 क्रॉस में न्यूनतम 1 सकारात्मक F1 मक्खियों की पहचान करना सुनिश्चित करें, क्योंकि ऑफ-टारगेट म्यूटेशन के कारण कुछ F1s बाँझ हो सकते हैं।
- निम्नलिखित पोस्ट-पीसीआर क्रॉस सेट-अप करें।
- जेल परिणामों के आधार पर, फ्लाई होटल से सकारात्मक मक्खियों का चयन करें और व्यक्तिगत रूप से उन्हें बैलेंसर मक्खियों (एफएम 7 / एल एक्स गुणसूत्र जीन टैगिंग के लिए) के साथ पार एफ 2 पीढ़ी का उत्पादन करने के लिए। एक बार एफ 2 पीढ़ी उभरता है, समरूप स्थिर स्टॉक (चित्रा 3 डी) बनाने के लिए भाई पार की स्थापना.
- सटीकता सुनिश्चित करने के लिए संपादन साइट के सेंगर अनुक्रमण के लिए समयुग्मजी स्टॉक का उपयोग करें। बैकक्रॉस ने पृष्ठभूमि उत्परिवर्तन को हटाने के लिए जंगली प्रकार की मक्खियों के साथ फ्लाई लाइनों को मान्य किया। सिंगल-लेग पीसीआर प्रोटोकॉल का उपयोग करके प्रत्येक पीढ़ी को स्क्रीन करें।
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Representative Results
हमारे प्रयोगों में, हम आम तौर पर सभी गुणसूत्रों (एक्स, द्वितीय, तृतीय) पर विभिन्न अंतर्जात टैग जीन के लिए स्क्रीनिंग में ~ 20% -30% की सफलता दर पाया. इस प्रक्रिया की दक्षता कई कारकों के आधार पर भिन्न हो सकती है, जैसे कि जीआरएनए चयन, जीन की प्रकृति और इंजेक्शन की गुणवत्ता। यहां, हम एमनियोनग्रीन फ्लोरोफोर13 के साथ अंतर्जात अवधि जीन को टैग करने के लिए हमारी रणनीति के परिणामों का वर्णन करते हैं। पीरियड जीन, डी मेलानोगास्टर के एक्स गुणसूत्र पर स्थित है, सर्कैडियन घड़ी में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। ड्रोसोफिला एक अच्छी तरह से विशेषता घड़ी नेटवर्क लगभग 150 घड़ी न्यूरॉन्स है कि घड़ी प्रोटीन17 व्यक्त से मिलकर.
हमने पीरियड प्रोटीन को अपने सी-टर्मिनल छोर पर हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन mNeonGreen के साथ टैग किया, जो एक दोहरे ग्लाइसिन लिंकर13 से जुड़ा है। प्लास्मिड इंजेक्शन के बाद, हमने FM0/L बैलेंसर के साथ G7 मक्खियों को पार किया और बाद में F1 पीढ़ी को काटा। विशेष पीसीआर प्राइमरों (तालिका 1) का उपयोग करके जांच की गई 126 एफ 1 मक्खियों में से, हमने 47 सकारात्मक मामलों की पहचान की, जिससे 37.3% सफलता दर प्राप्त हुई। इनमें से, हमने स्थिर स्टॉक का उत्पादन करने के लिए अतिरिक्त क्रॉस स्थापित करने के लिए 5 F1 व्यक्तियों का चयन किया। लिंग ने इस स्क्रीनिंग के दौरान सकारात्मक परिणाम दर को प्रभावित नहीं किया। टैग किए गए जीन की अनुक्रम सटीकता की पुष्टि करने के बाद, हमने टैग किए गए प्रोटीन (पीरियड-एमनियोनग्रीन)13की कार्यक्षमता की पुष्टि करने के लिए एमआरएनए दोलनों को सुनिश्चित करने के लिए व्यवहार आकलन और क्यूपीसीआर मूल्यांकन सहित नियंत्रण परीक्षणों को निष्पादित किया।
लाइव-इमेजिंग प्रयोग करने के लिए, हमने Clock856-GAL4 के साथ इन PERIOD-mNeonGreen मक्खियों को पार किया ; UAS-CD4-tdTomato उड़ता है, जहां Clock856-GAL4 सभी क्लॉक न्यूरॉन्स19 को लेबल करता है और CD4 एक ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन है जो सेल झिल्ली को लेबल करता है। लाइव-इमेजिंग प्रयोगों के लिए, हमने बर्फ-ठंडे श्नाइडर के ड्रोसोफिला माध्यम का उपयोग करके 3-4 वयस्क दिमागों को विच्छेदित किया। दिमाग को एक एयरस्कैन कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके घुड़सवार और चित्रित किया गया था। चित्रा 4 ड्रोसोफिला दिमाग में घड़ी न्यूरॉन्स के भीतर अवधि प्रोटीन प्रदर्शित प्रतिनिधि छवियों से पता चलता है.
चित्रा 1: सीआरआईएसपीआर/सीएएस 9-आधारित जीन संपादन प्रोटोकॉल का योजनाबद्ध। प्रोटोकॉल एसजीआरएनए और दाता प्लास्मिड को डिजाइन और इकट्ठा करने के लिए चरणों की एक श्रृंखला की रूपरेखा तैयार करता है, इसके बाद सिंगल-लेग पीसीआर विधि और स्थिर इंजीनियर लाइनों के उत्पादन के माध्यम से स्क्रीनिंग की जाती है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 2: अवधि-एमनियोनग्रीन मक्खियों को उत्पन्न करने के लिए सीआरआईएसपीआर/सीएएस 9 जीनोम संपादन का योजनाबद्ध। (ए) स्कीमा एक अंतर्जात जीन के सी-टर्मिनल के लिए एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन टैग के अतिरिक्त को दर्शाता है। (बी) अंतर्जात अवधि (प्रति) जीन को कार्बोक्सिल टर्मिनस पर एक उज्ज्वल, मोनोमेरिक ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन, एमनियोनग्रीन के साथ टैग किया गया है। दो sgRNAs क्रमशः अंतिम एक्सॉन और 3'UTR में हैं। दाता वेक्टर में दो ~ 1 केबी होमोलॉजी अनुक्रम होते हैं जो mNeonGreen टैग को फ़्लैंक करते हैं। उचित अनुवाद समाप्ति के लिए टैग के अंत में स्टॉप कोडन जोड़ा जाता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 3: सीआरआईएसपीआर-पॉजिटिव मक्खियों के लिए स्क्रीन करने की रणनीति। (ए) एक्स और द्वितीय गुणसूत्रों पर सीआरआईएसपीआर टैगिंग के लिए जीन के लिए प्री-स्क्रीनिंग जेनेटिक क्रॉस स्थापित करने के लिए दृष्टिकोण। G0 शुरू में इंजेक्ट की गई मक्खियों को दर्शाता है, जबकि F1 उनकी पहली पीढ़ी की संतानों का प्रतिनिधित्व करता है जिन्हें स्क्रीनिंग की आवश्यकता होती है। (बी) सिंगल-लेग पीसीआर स्क्रीनिंग विधि और प्रत्येक प्रक्रिया चरण की अवधि को रेखांकित किया गया है। (C) यहाँ फ्लाई होटल का चित्र दिखाया गया है। ग्लास ट्यूब फ्लाई फूड से भरे होते हैं और एक छोर पर सील कर दिए जाते हैं। एकल मक्खियों को अलग-अलग ट्यूबों में लोड किया जाता है। व्यक्तिगत मक्खियों के मध्य नेतृत्व से निकाले गए डीएनए का परीक्षण करने के बाद, उपयुक्त मक्खियों को फ्लाई होटल से लिया जाता है और स्थिर लाइनें स्थापित की जाती हैं। (डी) मक्खियों के पोस्ट-स्क्रीनिंग क्रॉस (नीले रंग में यहां दिखाए गए) को स्थापित करने के लिए दृष्टिकोण, जिसने स्क्रीनिंग टेस्ट पास किया। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 4: घड़ी न्यूरॉन्स में अवधि-mNeonGreen प्रोटीन की प्रतिनिधि छवियों. अवधि-mNeonGreen, Clock-GAL4, UAS-CD4-tdTomato मक्खियों से प्रतिनिधि छवियां लाइट-डार्क चक्रों में प्रवेश करती हैं। ZT Zeitgeber Time को संदर्भित करता है और ZT0 रोशनी के समय को संदर्भित करता है और ZT12 रोशनी बंद होने के समय को संदर्भित करता है। क्लॉक न्यूरॉन के परमाणु लिफाफे को tdTomato के साथ लेबल किया गया है, यहां लाल रंग में दिखाया गया है, और PERIOD प्रोटीन को mNeonGreen के साथ टैग किया गया है और हरे रंग में दिखाया गया है। पीरियड प्रोटीन को देर रात और सुबह के समय बिंदुओं पर असतत परमाणु foci में व्यवस्थित किया जाता है। स्केल बार, 1 माइक्रोन। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
| नाम | डीएनए अनुक्रम (5 'से 3') |
| पीरियड स्क्रीनिंग प्राइमर आगे | ATACTCGTCCATAGACCACG |
| पीरियड स्क्रीनिंग प्राइमर रिवर्स | ACATTATCCTCGGCTTGCAT |
| प्रति-जीआरएनए 1-भावना | cttcACCAGACACAGCACGGGGAT |
| प्रति-जीआरएनए 1-एंटीसेंस | aaacATCCCCGTGCTGTCTGGT |
| प्रति-जीआरएनए 2-भावना | सीटीटीसीजी |
| प्रति-जीआरएनए 2-एंटीसेंस | aaacCACCCGCAGTTGCTGCTGAC |
| अवधि होमोलॉजी हथियार और mNeonGreen सम्मिलित करें | GAATTCCAAGCTGCTCATCCTGCCCATTGTCAGCAA GGGCGACCTGACCATTCGGTTGAACGATGTGCACA CAAAGGTTTGGATTACCGCCGAGCCAGTGAAGCGC TCCGATGGCCACACCTATCTCAACATCACCGACTAC AAGACGGCCACCAAGATCAAGGGgtgagcatggcctgcat gtctagccaactgaatggtgacctcaaacctcttctcgtagTGGCCACT TTGACCTGTCGAATCTGTTCAACGACAACAAGGC GCGCGACAGCACGCTGAAGGTGCTGAACCAGGAGT GGAGCACCCTGGCCCTCGATGTCCAGCCGAAGATC AACGAGGCCTGCCCAAGGCCCCTTCAGTGCCATCGT ACAGAGTCTGTGGGCCAACATTCCCTACGACGAGTT CTTCGAAAAGGAATGAACGCATATATCTAACAAAGT CCGGTCTAACTAGCCACTCTAGCTAATTACTGATTAAA CTACCTAATTGCAGCTAAATCCAATCCATCTTCGATTAA AACAACTACAAGTTGGCGTTGGCTTTTCGATAT TTATTGTACAATAATAATAAAAAAAAAGATTCGGATATATA AACCTTAGGGCTGAGAAGGGTGGTTCGATGTTCGAAC CCTCTCTAGTTTTCAATTCACTTAATATTGATTAAACAT AGGATAGATATCATCTAAAAGCTTTGCTTGGCTTGAGAT CTACATTATCCTCGGCTTGCATGGGTTCTGGGCATCCTT CCACGTCAGTTCGTCTGATGCTTTCGTTTTTGTTCGGA TACTGAATGGTGACATCCCGGAAGCGTTCGCGTTGAT TCGAAGAActtgaagggaatggggtaggaataggaataggaactggtgg gactggctggtactcggtgcccagaccggaggcaatgctcacTCGTTTCCA GGACCCTGCTGCTCCTCGGTGTCTGCTGCTCGGATCATC CCAGGGATCGACATTGCACTCGGTTGTGTACGTCGGT CAGCAGCAACTGGGGTCATTACTTACAGTTCGT CCATACCCATGACATCGGTGAAAGCTTTTTGCCATTCTT TGAAATTCAGCTCTGTTTTCGAGTGCTTCAGTTCGGTTT TTCGAAAGACATACATCGGTTGGTTCTTGAGATAGTTAG CCGCCATCGGCTTGGCAAAAGTACGTTGTTCGCGCT GTGGAGCGATACCTTTTTTTTCCTCTGTTGTATAGGAC CATTTGAAAGTGGAAATAGTCTTATCATTGGGGTAG GTCTTTTTGCTGCGGCACCAGTCAGCGGCAGTGAGC GAATTTGTCATAACTGGGCCATCAGCGGGGAAACCCG TTCCCTTGACTTGGGCTTCGCCTTTATATGGCTACCT TCGTAAGTGTACCGATAGTTCACCGTGAGCGAGGCTC CGTCTTCAAATTGCATTGTTCGATGCACCTGGTAGCCC GAGCCATCTACCATCGCGGCTTGGAAGGGCGACATGC CATCTGGATACGGCAAATACTGATGGAATCCGTAACCG ATGTGTGGAACCAGGATCCAAGGGGAAAATTGGAGAT CGCCTTTAGTCGATTTCAGATTGAGTCTTCGTAGCC GTCGTTGGGGTTTCCCGTACCCTCCGACCATATC GAAGTCGACTCCATTGATCGAACCAAAGATATGCAG CTCGTGTGTAGCCGGCAACGAAGCCATATTATCTTC TTCACCCTTCGACACACCTCCCCGCCCGCT GTGTCTGGTCCTCCTCCGGGTGCTCCATGATCTTGC TCTCAGATGTGCTCATGCTctgcaaaaaacggaaatggatta cattgaatcgcatcgtggactgaactgtacgtacCTTCAGCTTTCGG TGCTTGGGGTCCTTTTCGGTCCGGCGGACTCTC CGATCCGTCCGTGGTCTTGATGAAGGACGAGTAGA AGGAGGAGAAGCTGGAGCCATCCATCGTCGTCGCTA TTCCCATTGCTGTCCGTATTTctgtggatgagaccatgttc ttcataatgaccaatcaccaatggacctcattcgtatagcatacCTTGTT GTTGGCGGGATTGCTGCTGCTGCAGGGGGGGCG GAGTTGTAGTCGCCCATCACGGAGGGAATGGGCGA GGAGTCCGGCACCTCTCTTGCAGGGATCGGATA CCGCTGCACTGGAGCCCGGCTCCGTCTTGACGGA TGCGCTGCGAGGGGACGCTGCACCTGGGC AGGAGTGGTGACCGAGTGGAATGCACCCGGCACC TTCTTCGTCATGGACGCCGGCGTGGTctatggacgagta Tggagttggagttggagttaagacagttcggtgaggcaccaccggccactg acttacCGTGTACACCGACTTGTTGTACGCGGATTGGG AGCCCAACGGACGTTCGGGAATCTGGAGCGTTG GCCATTCCCGGAAAGGGCATCGGCTGGTACATCAT GGCCGTGGCCGGGCCGCCGCCGGGTGTGTGTAG AAAAGCGAAGGATGCGGGTACATCCGCCGGCCAT GTACTGCAGCGGCATGGCCTGGGCGGCGGCCA GCCGCCTGCTGCGAGGTGGTGGTGGGCATGTCCGTGC CACCCTTGTGCGGATGCTTGCATCCGGGGAGAG CGCGTGGGACTGGTGGGCGTCAAGGAGGGGGGGGA TGTAGTAGAAGGTCGGGAGAGAGAGGCCGGGGGGGGGA GAAGCTGCTGGGCCATGGCCGTGGTGGTGGGGAG TGAACGGGCGGTGTGATGCCCACCGAACGGTG GCCAGAGGTTTATGTTCTAGA |
तालिका 1: "सी टर्मिनल पर अंतर्जात अवधि जीन को टैग करने के लिए एसजीआरएनए अनुक्रमों की सूची और सिंगल-लेग पीसीआर स्क्रीनिंग करने के लिए उपयोग किए जाने वाले प्राइमर".
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Discussion
परिणाम ड्रोसोफिला में अंतर्जात जीन को टैग करने के लिए एक सुव्यवस्थित, सरल एक-चरण सीआरआईएसपीआर-आधारित रणनीति प्रदर्शित करते हैं। प्रोटोकॉल में, हम डीएनए डबल-स्ट्रैंड ब्रेक और होमोलॉगस पुनर्संयोजन को अधिक कुशलता से प्रेरित करने के लिए दो जीआरएनए का उपयोग करते हैं। जीआरएनए और दाता प्लास्मिड को फल मक्खी भ्रूण में इंजेक्ट किया जाता है, जो उनके जर्मलाइन में कैस 9 एंजाइम व्यक्त करते हैं। इन भ्रूणों को बाद में वयस्कता तक मानक परिस्थितियों में खेती की जाती है, जिस बिंदु पर उन्हें पहली पीढ़ी (एफ 1) संतान पैदा करने के लिए बैलेंसर मक्खियों के साथ पार किया जाता है। पीसीआर जीनोटाइपिंग आनुवंशिक रूप से संशोधित मक्खियों के लिए स्क्रीन करने के लिए प्रत्येक एफ 1 नमूने के मध्य पैर पर किया जाता है। यह विधि वर्तमान स्क्रीनिंग विधियों पर एक महत्वपूर्ण लाभ प्रदान करती है जो स्क्रीनिंग के दो चरणों का उपयोग करती है, जहां पहला चरण उपयुक्त जीनोटाइप की पहचान करने के लिए आंखों के रंग जैसे दृश्यमान मार्कर का उपयोग करने पर निर्भर करता है और दूसरे चरण में आंखों के रंग मार्कर10 को हटाना शामिल है। यहां, हम एक व्यक्तिगत मक्खी के मध्य पैर के एक छोटे से खंड से निकाले गए डीएनए पर पीसीआर को नियोजित करने वाली एक विधि प्रस्तुत करते हैं, जो व्यक्तिगत मक्खियों के गैर-घातक जीनोटाइपिंग की अनुमति देता है, जो मौजूदा तरीकों के लिए अधिक कुशल और लागत प्रभावी विकल्प प्रदान करता है। यह विधि उम्मीदवार जानवरों की स्क्रीनिंग को एक-एक करके या बैचों में तब तक अनुमति देती है जब तक कि उपयुक्त जीनोटाइप अलग न हो जाए। उपयुक्त स्टॉक को अलग करने से पहले जांच किए गए जानवरों की संख्या प्रयोग से प्रयोग में भिन्न होती है, जो चयनित एसजीआरएनए की दक्षता, इंजेक्शन की दक्षता, ऑफ-टारगेट सम्मिलन सहित कई कारकों पर निर्भर करती है जो व्यवहार्यता को प्रभावित कर सकती है। वैकल्पिक रूप से, व्यक्तिगत मक्खियों से एकल पंखों से डीएनए भी जीनोटाइपिंग प्रयोजनों18 के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
यह संभव है कि जीन के एन- या सी-टर्मिनल में एक टैग जोड़ने से जीन के कार्य पर प्रतिकूल प्रभाव पड़ सकता है, जो मक्खियों की व्यवहार्यता को संभावित रूप से प्रभावित कर सकता है। यदि प्रोटीन संरचना की जानकारी उपलब्ध है, तो इसका उपयोग यह निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है कि क्या एन- या सी-टर्मिनल टैगिंग देशी प्रोटीन के कार्य और स्थानीयकरण को बेहतर ढंग से संरक्षित कर सकती है। यह हमेशा नियंत्रण प्रयोगों प्रदर्शन करने के लिए सिफारिश की है, परीक्षण सहित कि क्या टैग प्रोटीन एंटीबॉडी धुंधला तरीकों से जंगली प्रकार प्रोटीन के रूप में इसी तरह स्थानीयकरण पैटर्न से पता चलता है. एक ही स्क्रीनिंग रणनीति का उपयोग अन्य प्रकार के सीआरआईएसपीआर-आधारित आनुवंशिक सम्मिलन या विलोपन को स्क्रीन करने के लिए किया जा सकता है। अंत में, एक-चरण स्क्रीनिंग रणनीति सीआरआईएसपीआर-संपादित मक्खियों को उत्पन्न करना बहुत आसान बनाती है और अपने मूल संदर्भ में अंतर्जात जीन के उपकोशिकीय स्थानीयकरण और गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए कई संभावनाएं खोलती है।
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Disclosures
लेखक कोई प्रतिस्पर्धी हितों की घोषणा नहीं करते हैं।
Acknowledgments
हम प्रोटोकॉल विकास के प्रारंभिक चरणों के दौरान चर्चा के लिए जॉर्ज वातासे और जोसी क्लॉनी को धन्यवाद देते हैं। काम को एनआईएच (अनुदान संख्या R35GM133737 से एसवाई), अल्फ्रेड पी. स्लोन फैलोशिप (एसवाई को) और मैकनाइट स्कॉलर अवार्ड (एसवाई को) से धन द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5M EDTA pH8.0 | Invitrogen | AM9260G | |
| 5-alpha Competent E. coli (High Efficiency) | NEB | C2987H | |
| 96-well deep well plate | BRAND | 701354 | |
| Agar | Fisher Scientific | BP1423-500 | |
| BbsI-HF | NEB | R3539S | |
| DreamTaq Green PCR Master Mix (2X) | Thermo Scientific | K1081 | |
| D-Sucrose | Fisher Scientific | BP220-1 | |
| EcoRI-HF | NEB | R3101S | |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A142-212 | |
| Prolong Glass Antifade Mounting Medium | Invitrogen | P36982 | |
| Proteinase K | QIAGEN | 19131 | |
| Schneider's Drosophila Medium | Gibco | 21720001 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-500 | |
| T4 DNA ligase | NEB | M0202S | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-500 | |
| XbaI | NEB | R0145S |
References
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