从多能干细胞生成人体血管类器官

本文进行的所有实验均使用市售的H9人iPSC系。常见的商业和非商业上可获得的人多能干细胞系（即H9，NC8）也已经过测试，并证明使用该协议可有效生成人血管类器官。有关详细信息，请参阅我们之前发布的报告8，10。 1. 用于生成人体血管类器官的培养基和试剂制剂 准备聚合介质。将 40 mL 敲除 DMEM/F12（不含 L-谷氨酰胺或针对人 ESC 和 iPSC 生长优化的 HEPES 缓冲液的低渗透压培养基）、10 mL 敲除血清替代品 （KOSR）、0.5 mL 200 mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽与 0.85% NaCl、0.5 mL 非必需氨基酸 （NEAA）、35 μL β-巯基乙醇（BME、100 μL 2-巯基乙醇在 10 mL 无菌 PBS 中）， 和Y-27632（Rho相关，含有蛋白激酶[ROCK]14 [10mM]的Rho相关线圈的细胞渗透性和选择性抑制剂，在1：200）（见 材料表）。 准备N2B27（N2和B27补充的碱性培养基）。将 25 mL DMEM/F12、25 mL 神经基础培养基、1 mL B27 补充剂、0.5 mL N2 补充剂、250 μL 200 mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽在 0.85% NaCl 中和 35 μL β-巯基乙醇混合（参见 材料表）。 准备中胚层诱导培养基。用 ChiR（12 μM，GSK3a/b 抑制剂刺激中胚层诱导）和 BMP-4（30 ng/mL，MSX2 激活剂诱导中胚层谱系）补充 N2B27 培养基。注意：库存 （ChiR）：10 mM（使用 1：833 或 1.2 μL/mL N2B27）。储备液 （BMP-4）：100 μg/mL（使用 1：3333，或 0.3 μL/mL N2B27）（参见 材料表）。 准备血管诱导培养基。用VEGFA（100ng / mL）和毛喉素（2μM）补充N2B27培养基（见 材料表）。 准备细胞外基质（ECM）。将 1 mL ECM 用于 12 孔板的一个孔（用于包埋 30-50 个聚集体）。在用于每个孔的 1 mL ECM 溶液中，使用 0.5 mL 创建底层“第 1 层”，用作 ECM 基础，并使用 0.5 mL 加聚集体用于顶层“第 2 层”。使用这种方法，通过ECM悬浮液，为人体血管网络向各个方向发芽提供了足够的空间和支持。注意：总体而言，1 mL ECM 含有 500 μL 纯化牛胶原蛋白 I 型、250 μL 由 Engelbreth-Holm-Swarm 小鼠肉瘤细胞分泌的可溶基底膜基质（参见 材料表）和 250 μL 碱性基质溶液（步骤 1.5.2）。新鲜准备并放在冰上直到准备使用。 要制备四个 12 孔板（48 孔）的基本基质溶液，混合 5.627 mL 的 0.1 N NaOH、2.498 mL 的 10x DMEM、473 μL HEPES、368 μL 7.5% 碳酸氢钠、233 μL 200 mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽的 0.85% NaCl 溶液和 3.451 mL Ham’s F-12（参见 材料表）。注意：剩余的碱性基质溶液可以放置在带盖的50 mL高透明度聚丙烯锥形管中，并在4°C下储存长达2个月。 准备发芽培养基。专门配制 50 mL 无血清柔性培养基 （SFM） 以支持人造血细胞的发育、1.3 mL 等分试样的无血清柔性培养基营养补充剂、15% 胎牛血清 （FBS）、250 μL 青霉素-链霉素、500 μL 200 mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽，含 0.85% NaCl、VEGFA （100 ng/mL） 和 FGF2 （100 ng/mL）（参见 材料表）。 准备阻塞缓冲区。混合 0.5 g 牛血清白蛋白、1.5 mL 胎牛血清、250 μL 吐温 20、250 μL Triton X-100、500 μL 脱氧胆酸钠（1% wt/vol 原液）和 47.5 mL 1x 磷酸盐缓冲盐水（参见 材料表）。上下移液，直到所有组件都充分结合并且溶液澄清。 2. 人多能和诱导多能干细胞的维持与培养 使用不含LDEV的低生长因子基底膜基质（1：50稀释）包被的6孔组织培养板和干细胞培养基进行细胞培养（参见 材料表）。 一旦细胞达到~70%汇合度，使用1mL哺乳动物细胞解离酶（参见 材料表）在37°C下传代3-4分钟。注意：以1：6的比例分裂细胞可增强细胞活力，并在大多数人类干细胞系的2-4天内实现汇合。为了提高细胞活力，使用ROCK抑制剂Y-27632补充（10mM，1：1，000）培养基进行传代后24小时。 每天更换培养基，直到达到70%的汇合度。注意：对于本研究，在70%汇合度下，6孔细胞培养板的一个孔含有约100万个H9 hPSC。 3. 第 0 天 – 从单细胞悬液生成多能聚集体 注意：在 6 孔培养板的两个孔中汇合度为 70% 将产生大约 175 hBBO。 使用移液器或真空系统吸出培养基，用1mL细胞解离试剂替换（参见 材料表），并在37°C下孵育5分钟。 当细胞在细胞解离试剂下时，根据需要在 15 mL 锥形管中制备必要体积的聚集培养基（步骤 1.1），以满足 6 孔超低附着培养板中所需孔数的需要（参见 材料表）。 吸出 1 mL 细胞解离试剂，并将细胞悬浮在 1 mL 聚集培养基中。在计数样品之前，使用轻柔的上下移液创建单细胞悬液。注意：hPSC对机械应力非常敏感，不能耐受剧烈移液。 使用自动细胞计数装置10 或显微镜下的标准化系统对细胞进行计数。计算实验所需的细胞数。注意：根据细胞系的不同，200，000 个细胞/孔到 300，000 个细胞/孔被认为是聚集体形成的理想选择（即，4 孔 = 总共 800，000 至 1，200，000 个细胞）。 将适当体积的细胞悬液添加到 15 mL 高透明度聚丙烯锥形管中的聚集培养基中。轻轻上下移液稀释的细胞悬液，以确保均匀的细胞分布。 将 3 mL 稀释的细胞悬液移液到 6 孔超低附着培养板的每个所需孔中。 将板放入培养箱（37°C，5%CO2，>90%湿度），并尽可能避免打开和关闭培养箱门。注意：此初始步骤最好在晚上或孵化器流量低时完成。即使是轻微的振动也会影响骨料的大小和形状，从而影响结果。 4. 第 1 天 – 聚集体的中胚层诱导 确保接种后24小时，在显微镜下可以看到包含2-10个细胞的小聚集体。收集聚集体，并在将培养基更换为中胚层诱导培养基之前让它们沉降（步骤1.3）。 在 6 孔超低附着培养板的每个孔中设置一个 15 mL 高透明度聚丙烯锥形管。 使用圆周运动（即像轨道摇床一样）将聚集体聚集在每个孔的中心，使用 1 mL 移液器从每个孔中轻轻收集聚集体和周围培养基，将它们放入相应的 15 mL 高透明度聚丙烯锥形管中，并让聚集体在室温下沉淀。 收集后，将计时器设置为1小时，这是大多数细胞系/聚集体在此阶段沉淀所需的时间。注意：如果时间小于 1 小时，则可能会丢失任何可能未沉降到 15 mL 锥形管底部的聚集体。 一小时过去后，请谨慎用移液管或高灵敏度吸液泵吸出上清液。确保聚集体在 15 mL 锥形管底部保持不受干扰。 将每个 15 mL 锥形管的聚集体重悬于 2 mL 中胚层诱导培养基中，并将它们放回 6 孔超低附着培养板的相应孔中。 将板放回培养箱（37°C），并将其放置至第4天。注意：如果聚集体相互附着或生长，请使用 1 mL 移液器，每天轻轻上下移取每个聚集体孔一次，以保持聚集体大小相似。 5. 第 4 天 – 血管诱导和聚集体启动 收集聚集体，并在将培养基更换为血管诱导培养基之前让它们沉降（步骤1.4）。 在 6 孔超低附着培养板的每个孔中设置一个 15 mL 锥形管。 使用圆周运动（即，像轨道摇床一样）将聚集体聚集在每个孔的中心，使用 1 mL 移液器轻轻收集每个孔中的聚集体和周围培养基，并将它们放入相应的 15 mL 锥形管中。 收集后，将计时器设置为30分钟，以使聚集体沉积。注意：在此阶段，大多数细胞系需要30分钟的时间。如果时间少于 30 分钟，则存在丢失任何可能未沉降到 15 mL 锥形管底部的聚集体的风险。 30分钟后，小心用移液管或高灵敏度吸气泵吸出上清液。确保聚集体在 15 mL 锥形管底部保持不受干扰。 将每个 15 mL 锥形管的聚集体重悬于 2 mL 血管诱导培养基中，并将它们放回 6 孔超低附着培养板的相应孔中。 将板放回培养箱（37°C），并将其放置至第6天。注意：使用1 mL移液器，每天轻轻上下移液每个聚集体孔一次，以保持聚集体的大小相似，并防止它们相互生长或附着。 6. 第 6 天 – 骨料包埋和血管发芽诱导 在冰上工作时，准备所需的ECM溶液的最终体积（步骤1.5）。注意：以下是12孔板（30-50个聚集体）的一个孔的协议，可以根据需要进行调整。对于 12 孔板的一个孔，涂上 0.5 mL ECM 作为底层，并在顶层使用 0.5 mL ECM 加聚集体。这创造了有效的3D骨料发芽所必需的ECM“三明治”。 将 500 μL ECM 移液到 12 孔板的一个孔中。确保没有形成气泡，并且井底和侧面弯月面完全覆盖。这包括ECM三明治的第1层。 将板放回37°C下2小时。注意：有效聚合需要2小时的时间。任何较短的时间都有可能损害 ECM 的完整性。 在第 1 层聚合结束时，使用圆周运动将聚集体聚集在每个孔的中心，使用 1 mL 移液器轻轻收集每个孔中的聚集体和周围培养基，并将它们放入相应的 15 mL 锥形管中。 让聚集体沉淀10-15分钟，并吸出上清液。 将聚集体放入冰上的 15 mL 锥形管中 5 分钟。冷却时，将带有现已聚合的第 1 层的 12 孔板从培养箱中取出。注意：冷却聚集体有助于防止第 2 层 ECM 的早期聚合。 快速小心地工作以防止气泡形成，将聚集体重悬于 500 μL ECM 中，并将 ECM 聚集体悬浮液移液到已经聚合的第 1 层上。注意不要接触第 1 层，请使用 200 μL 移液器吸头轻轻分布第 2 层和孔周围的聚集体。 将板放回37°C下2小时。注意：有效的ECM聚合需要2小时的孵育时间。任何较短的时间都有可能损害 ECM 完整性，并可能阻止第 1 层和第 2 层之间的强粘附。 加入 1 mL 预热 （37 °C） 发芽培养基（步骤 1.6）以诱导血管分化。发芽血管必须在包埋后 1 天至 3 天出现。3天后更换培养基，然后每隔一天更换一次。注意：发芽介质必须预热;否则，可能会发生层分离，并且可能会影响 ECM 完整性。 7. 第11天 – BVO的分离和成熟 在无菌条件下工作，使用无菌刮刀的圆形端松开包含血管网络的ECM发芽基质。在这个阶段，凝胶必须类似于一个自由漂浮的圆盘。使用无菌镊子和无菌刮刀的圆形端，小心地将凝胶盘（包括血管网络）转移到10厘米培养皿的盖子上。 将盖子加凝胶置于调节到所需放大倍数和焦点的立体显微镜下，并使用无菌针头切出单血管网络，试图限制在此过程中获得的非血管化ECM的量。注意：随着时间的推移，细胞会自然降解周围的ECM;然而，减少每个类器官的切口量可以提高图像质量和独立式容器网络的完整性。 从凝胶中分离出所有类器官后，将它们轻轻地转移回带有 3 mL 发芽培养基的超低附着 6 孔板的一个孔中。在此阶段，类器官可以放置过夜，或者可以立即继续步骤7.4。 使用 1 mL 移液器将单个类器官从 6 孔板转移到超低附着 96 孔板的孔中。转移后，向 96 孔板的每个孔中加入 200 μL 预热 （37 °C） 发芽培养基。注意：来自 12 孔板的一孔血管类器官必须填充 96 孔板的 30-40 孔。 在96孔板中分离后4-6天，确保类器官具有圆形和健康的形态。在此阶段，类器官已准备好固定并准备染色。 8. 第 15 天 – BVO 的固定、封闭和染色 使用切开的 1 mL 吸头，将类器官转移到 1.5 mL 微量离心管中。 小心避免吸入任何 BVO，使用 200 μL 或 1，000 μL 移液器去除微量离心管中剩余的发芽培养基，然后在 PBS 中加入 1 mL 的 4% PFA 1 小时。注意：建议在室温下固定在轨道振荡器（125 rpm）上。最多可以接受 60 个 BVO/微量离心管。任何更多的BVO都会损害固定和洗涤效果。注意：PFA是一种有害化学物质。在通风橱中谨慎使用，并遵循制造商的使用说明和适当的处置方法。 每次用0.25%PBS-吐温洗涤新固定的BVO3次15分钟。 如果类器官直径大于1mm，则在室温下用PBS中的1%Triton X-100透化BVO30-60分钟。 吸出所有 0.25% PBS-吐温，并加入 1 mL 封闭缓冲液（步骤 1.7）。注意：虽然抗体依赖性，但在室温下在轨道摇床（125rpm）上2小时足以减少染色过程中的非特异性抗体结合。类器官可以在4°C的封闭缓冲液中保留长达2周。 取出封闭缓冲液，加入在 1 mL 封闭缓冲液中稀释的一抗 （1：100）。在轨道摇床（12rpm）上在4°C下保持过夜，确保类器官保持浸没在一抗溶液中。注意：过夜一抗孵育适用于本研究中使用的抗体。材料 表中提供了必要的一抗和二抗及其各自的稀释度。 一抗孵育过夜后，取出一抗溶液，每次用0.25%PBS-吐温洗涤3次15分钟。 加入二抗（1：250）加在1mL封闭缓冲液中稀释的DAPI（1：1，000），并在室温或4°C孵育2小时过夜。注意：如果样品制备正确（如上所述），则在室温或4°C孵育2小时过夜适用于本研究中使用的抗体。 孵育后，除去二抗溶液，每次用0.25%PBS-吐温洗涤3次15分钟。注意：染色后，类器官可以在PBS中保存长达2周。 9. 血管类器官（BVO）的安装 将安装垫片粘在所需的成像盖玻片上（见 材料表）。 使用切开的 1 mm 移液器吸头，使用 1 mL 移液器将单个类器官转移到间隔孔中，并吸出剩余的 PBS。 用加热至75°C的150-200μL透明溶液（参见 材料表）填充孔，完全浸没类器官。注意：样品应在暴露于加热的澄清溶液后1小时内变得透明。如果1小时清除时间不足，则将类器官在室温下在黑暗的有盖盒子中透明6小时至过夜。如果将样品放置过夜，请确保其有足够的清除溶液以避免变干。 清除后，用 100-200 μL 移液器吸头小心吸出澄清溶液。轻轻地将类器官移动到间隔孔的中心，并加入几滴安装凝胶（参见 材料表）（在受控加热块中加热至75°C），直到孔充满。 轻轻地将第二张盖玻片放在安装垫片的顶部，将样品密封在底部和顶部盖玻片之间的空间中。让封片凝胶在4°C的黑暗中固化过夜。注意：固化后，可以使用面漆指甲油进一步密封已安装的样品。