Saggio di sedimentazione basato sulla concanavalina A per misurare il legame del substrato delle fosfatasi glucane

Le fosfatasi glucane sono membri di una sottofamiglia funzionalmente diversificata di fosfatasi a doppia specificità (DSP) all’interno della^{superfamiglia 1} della proteina tirosina fosfatasi (PTP). Sono stati trovati nella maggior parte delle forme di vita, inclusi organismi fotosintetici ampiamente divergenti, esseri umani, vertebrati e alcuni invertebrati e protisti ^2,3,4. Le piante contengono tre fosfatasi glucane note: Starch Excess4 (SEX4), Like Sex Four1 (LSF1) e Like Sex Four2 (LSF2)^5,6,7. Le piante che mancano di fosfatasi glucano mostrano tassi ridotti di degradazione transitoria dell’amido e accumulo di amido nelle foglie ^8,9. Laforin è il membro fondatore della famiglia delle fosfatasi glucane che defosforila il glicogeno nei vertebrati e nell’uomo ^3,10. Le mutazioni della laforina provocano la malattia neurodegenerativa di Lafora, una forma autosomica recessiva fatale di epilessia¹¹. Le fosfatasi glucane sono necessarie per il metabolismo del glicogeno e dell’amido e sono emerse come enzimi importanti per modulare il contenuto di amido nelle piante e trattare la malattia neurodegenerativa di Lafora^12,13. Recenti studi di cristallografia a raggi X sulle fosfatasi glucane con substrati di glucano modello hanno fatto luce sul legame del substrato e sul meccanismo catalitico della defosforilazione del glucano^14,15,16,17. Tuttavia, l’attuale comprensione di come le fosfatasi glucane si leghino ai loro substrati fisiologici è incompleta.

L’amido è un polimero insolubile di glucosio composto da 80% -90% amilopectina e 10% -20% amilosio¹⁸. I substrati per le fosfatasi glucane delle piante sono molecole di carboidrati fosforilati, come glicogeno e granuli di amido. I residui glucosilici fosforilati sono presenti con un rapporto fosfato/residuo glucosilico di 1:600. È interessante notare che i fosfati sono presenti solo sulle molecole di amilopectina¹⁹. La principale glucanofosfatasi SEX4 agisce sul granulo di amido per defosforilare le molecole di amilopectina. La struttura cristallina a raggi X di SEX4 combinata con studi di mutagenesi guidati dalla struttura ha dimostrato le specificità uniche del substrato di SEX4 per diverse posizioni all’interno di una struttura glucana¹⁵. Abbiamo recentemente dimostrato che l’attività biologicamente rilevante di SEX4 può essere osservata solo quando agisce sui suoi substrati solubilizzati di amilopectina²⁰. Tuttavia, la comprensione delle interazioni glucano-SEX4 si è dimostrata difficile a causa della complessità strutturale del substrato, delle più ampie specificità di legame e delle basse affinità di legame tra la proteina e i suoi substrati. Questi problemi hanno ostacolato la capacità di utilizzare metodi comunemente usati nelle interazioni proteina-ligando, come la calorimetria isotermica di titolazione (ITC), la spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR) e i saggi basati su saggi basati su immunoassorbimento enzimatico (ELISA).

È interessante notare che gran parte della nostra comprensione delle interazioni carboidrati-proteine proviene dallo studio delle lectine. La concanavalina A (ConA) è una famiglia di lectine leguminose originariamente estratte dal fagiolo. ConA lega i carboidrati con elevata specificità, il che è vantaggioso per il suo uso in applicazioni di targeting e somministrazione di farmaci. Il legame di ConA ad una varietà di substrati contenenti α-D-mannosil e α-D-glucosil non riducenti è stato ampiamente studiato^19,20. Le perle di selosorosio legate al ConA disponibili in commercio sono comunemente usate per purificare glicoproteine e glicolipidi²¹. ConA si lega a questi glucani attraverso i gruppi ossidrilici C3, C4 e C6 dei residui di glucosio. Le perle di ConA-Sepharose sono state utilizzate con successo anche per misurare il legame delle interazioni glicogeno-proteina e amido-proteina^22,23. In questo studio, abbiamo utilizzato perle di ConA-Sepharose per sviluppare un test di legame per misurare le specificità di legame delle interazioni glucano-fosfatasi-amilopectina.

In precedenza, è stato utilizzato un saggio di sedimentazione basato su ConA per valutare la capacità di legame del substrato di glucanofosfatasi^14,20,24. In questo studio, la stessa strategia è stata utilizzata per sviluppare un nuovo metodo per determinare l’affinità di legame delle interazioni glucano-glucano-fosfatasi e carboidrati. Questo metodo ha anche un vantaggio per studiare varie interazioni carboidrati-proteine solubilizzate.