Essai de sédimentation basé sur la concanavaline A pour mesurer la liaison au substrat des phosphatases glucanes

Les phosphatases glucanes sont membres d’une sous-famille fonctionnellement diversifiée de phosphatases à double spécificité (DSP) au sein de la superfamille¹ de la protéine tyrosine phosphatase (PTP). Ils ont été trouvés dans la plupart des formes de vie, y compris les organismes photosynthétiques très divergents, les humains, les vertébrés et certains invertébrés et protistes ^2,3,4. Les plantes contiennent trois phosphatases glucanes connues : Starch Excess4 (SEX4), Like Sex Four1 (LSF1) et Like Sex Four2 (LSF2)^5,6,7. Les plantes dépourvues de phosphatases glucanes présentent une diminution des taux de dégradation transitoire de l’amidon et d’accumulation d’amidon dans les feuilles ^8,9. La laforine est le membre fondateur de la famille des phosphatases glucanes qui déphosphoryle le glycogène chez les vertébrés et les humains ^3,10. Les mutations de la laforine entraînent la maladie neurodégénérative de Lafora, une forme autosomique récessive mortelle de l’épilepsie¹¹. Les phosphatases glucanes sont nécessaires au métabolisme du glycogène et de l’amidon et sont apparues comme des enzymes importantes pour moduler la teneur en amidon des plantes et traiter la maladie neurodégénérative de Lafora^12,13. Des études récentes de cristallographie aux rayons X sur des phosphatases de glucane avec des substrats de glucane modèles ont mis en lumière la liaison du substrat et le mécanisme catalytique de la déphosphorylation du glucane^14,15,16,17. Cependant, la compréhension actuelle de la façon dont les phosphatases glucanes se lient à leurs substrats physiologiques est incomplète.

L’amidon est un polymère insoluble de glucose composé de 80% à 90% d’amylopectine et de 10% à 20% d’amylose¹⁸. Les substrats des phosphatases de glucane végétaux sont des molécules de glucides phosphorylés, telles que le glycogène et les granules d’amidon. Les résidus de glucosyle phosphorylés sont présents à un rapport phosphate:glucosyl de 1:600. Fait intéressant, les phosphates ne sont présents que sur les molécules d’amylopectine¹⁹. La plante principale glucane phosphatase SEX4 agit sur le granule d’amidon pour déphosphoryler les molécules d’amylopectine. La structure cristalline en rayons X de SEX4 combinée à des études de mutagénèse guidée par la structure a démontré les spécificités uniques du substrat de SEX4 pour différentes positions au sein d’une structure de glucane¹⁵. Nous avons récemment montré que l’activité biologiquement pertinente de SEX4 ne peut être observée que lorsqu’elle agit sur ses substrats d’amylopectine solubilisés²⁰. Cependant, la compréhension des interactions glucane-SEX4 s’est avérée difficile en raison de la complexité structurelle du substrat, des spécificités de liaison plus larges et des faibles affinités de liaison entre la protéine et ses substrats. Ces problèmes ont entravé la capacité d’utiliser des méthodes couramment utilisées dans les interactions protéine-ligand, telles que la calorimétrie de titrage isotherme (ITC), la spectroscopie par résonance magnétique nucléaire (RMN) et les tests basés sur des tests immuno-enzymatiques (ELISA).

Fait intéressant, une grande partie de notre compréhension des interactions glucides-protéines provient de l’étude des lectines. La concanavaline A (ConA) est une famille de lectines de légumineuses extraites à l’origine du haricot jacquier. ConA lie les glucides avec une spécificité élevée, ce qui est avantageux pour son utilisation dans les applications de ciblage et d’administration de médicaments. La liaison de ConA à une variété de substrats contenant du α-D-mannosyl non réducteur et du α-D-glucosyl a été largement étudiée^19,20. Les billes de sépharose liées à ConA disponibles dans le commerce sont couramment utilisées pour purifier les glycoprotéines et les glycolipides²¹. ConA se lie à ces glucanes via les groupes hydroxyles C3, C4 et C6 des résidus de glucose. Les billes ConA-Sepharose ont également été utilisées avec succès pour mesurer la liaison des interactions glycogène-protéine et amidon-protéine^22,23. Dans cette étude, nous avons utilisé des billes ConA-Sepharose pour développer un test de liaison afin de mesurer les spécificités de liaison des interactions phosphatase-amylopectine glucane.

Auparavant, un test de sédimentation basé sur ConA a été utilisé pour évaluer la capacité de liaison du substrat de la phosphatase^{glucane 14,20,24}. Dans cette étude, la même stratégie a été utilisée pour développer une nouvelle méthode permettant de déterminer l’affinité de liaison de la phosphatase glucane-glucane et des interactions glucidiques. Cette méthode présente également un avantage pour étudier diverses interactions glucides-protéines solubilisées.