Screening von Spermien zur schnellen Isolierung von Keimbahnveränderungen im Zebrafisch
Summary
Die CRISPR-Cas-Technologien haben die Genom-Editierung revolutioniert. Das Finden und Isolieren der gewünschten Keimbahnreduktion bleibt jedoch ein großer Engpass. Daher beschreibt dieses Protokoll eine robuste Methode zum schnellen Screening von F0 CRISPR-injizierten Zebrafischspermien auf Keimbahn-Editierungen unter Verwendung von Standard-PCR-, Restriktionsverdauungs- und Gelelektrophoresetechniken.
Abstract
Das Aufkommen zielgerichteter CRISPR-Cas-Nuklease-Technologien hat die Fähigkeit revolutioniert, sowohl in etablierten als auch in neu entstehenden Modellsystemen eine präzise Genom-Editierung durchzuführen. CRISPR-Cas-Genomeditierungssysteme verwenden eine synthetische Guide-RNA (sgRNA), um eine CRISPR-assoziierte (Cas) Endonuklease auf bestimmte genomische DNA-Loci auszurichten, wobei die Cas-Endonuklease einen Doppelstrangbruch erzeugt. Die Reparatur von Doppelstrangbrüchen durch intrinsische fehleranfällige Mechanismen führt zu Insertionen und/oder Deletionen, die den Locus stören. Alternativ kann der Einschluss von doppelsträngigen DNA-Donoren oder einzelsträngigen DNA-Oligonukleotiden in diesen Prozess die Einbeziehung präziser Genom-Editierungen hervorrufen, die von Einzelnukleotid-Polymorphismen über kleine immunologische Markierungen bis hin zu großen fluoreszierenden Proteinkonstrukten reichen. Ein großer Engpass bei diesem Verfahren kann jedoch darin bestehen, die gewünschte Bearbeitung in der Keimbahn zu finden und zu isolieren. Dieses Protokoll beschreibt eine robuste Methode zum Screening und zur Isolierung von Keimbahnmutationen an bestimmten Loci in Danio rerio (Zebrafisch); Diese Prinzipien können jedoch in jedem Modell adaptiert werden, in dem eine In-vivo-Spermienentnahme möglich ist.
Introduction
Das CRISPR-System (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Durchführung von Loci-spezifischer Mutagenese und präziser Genom-Editierung im Danio rerio (Zebrafisch) Modellsystem 1,2,3,4. Das Cas-Ribonukleoprotein (RNP) besteht aus zwei Hauptkomponenten: einer Cas-Endonuklease (üblicherweise Cas9 oder Cas12a) und einer locusspezifischen synthetischen Guide-RNA (sgRNA)5. Zusammen erzeugen die Cas-RNP einen doppelsträngigen Bruch (DSB) im gewünschten Locus, der durch einen von zwei intrinsischen Reparaturmechanismen repariert werden kann. Der Reparaturmechanismus der nicht-homologen Endverknüpfung (NHEJ) ist fehleranfällig und führt häufig zu einer Vielzahl von Insertionen oder Deletionen (Indels) um das DSB herum. Diese Indels können schädlich sein, wenn sie eine Frameshift-Mutation oder einen vorzeitigen Stopp in der resultierenden Proteinsequenz einführen. Alternativ verwendet der Homologie-gerichtete Reparaturmechanismus (HDR) eine Spenderschablone mit Homologieregionen, die die DSB-Stelle umgeben, um den Schaden zu reparieren. Forscher können das HDR-System nutzen, um präzise genomische Bearbeitungen zu generieren. Konkret können sie ein doppelsträngiges DNA-Spenderkonstrukt koinjizieren, das die gewünschten Bearbeitungen sowie Homologieregionen enthält, die die DSB-Stelle im Genom flankieren. Die erhöhten Skaleneffekte für diese kommerziell hergestellten CRISPR-Komponenten haben die Hürden für das Screening mehrerer Loci und für die Einrichtung größerer Anstrengungen zur präzisen Genom-Editierung erheblich verringert. Ein großer Engpass bei der sexuell reproduzierenden Tiervermehrung ist jedoch die Identifizierung und Isolierung keimbahnstabiler mutierter Tiere.
Das Zebrafisch-Modellsystem weist mehrere Schlüsseleigenschaften auf, die seine Verwendung in reversen genetischen Studien verbessern. Sie lassen sich leicht in großer Zahl aufziehen, und die Weibchen weisen das ganze Jahr über eine hohe Fruchtbarkeit auf6. Darüber hinaus sind sie durch ihre äußere Eiablage und Befruchtung für die Mikroinjektion von CRISPR/Cas-Komponenten zugänglich. Das Cas-RNP wird üblicherweise in Zebrafischembryonen im Ein-Zell-Stadium injiziert, um DSBs/Reparaturen zu erzeugen, die theoretisch von allen Tochterzellen vererbt werden. Diploide Genome benötigen jedoch zwei DSB/Reparaturereignisse, um beide homologen Chromosomen zu mutagenisieren. Obwohl Cas-RNP im Ein-Zell-Stadium injiziert wird, kann es sein, dass die DSB/Reparatur erst zu einem späteren Zeitpunkt in der Entwicklung erfolgt. Zusammen tragen diese Faktoren zur Mosaiknatur von F0-injizierten Fischen bei. Eine gängige Praxis ist es, F0-injizierte Fische zu kreuzen und die F1-Nachkommen auf Indels/spezifische Bearbeitungen zu untersuchen. Da jedoch nicht alle F0-injizierten Fische Keimbahnmutationen aufweisen, führt diese Praxis zu vielen unproduktiven Kreuzungen, die nicht den gewünschten Edit erzeugen. Das Screening der F0-Keimbahn anstelle des F1-Samengewebes erhöht die Wahrscheinlichkeit, die gewünschte Keimbahnreduktion zu isolieren, und reduziert die Anzahl der für diesen Prozess erforderlichen Tiere.
Spermien können leicht aus F0-injizierten Zebrafischen entnommen werden, ohne dass eine Euthanasie erforderlich ist. Diese Funktion ermöglicht die Kryokonservierung und Rederivation von gefrorenen Spermienbeständen7, kann aber auch genutzt werden, um die Keimbahnträger der gewünschten genomischen Mutationen 8,9 schnell zu screenen, zu identifizieren und zu isolieren. Brocal et al. (2016) beschrieben zuvor eine sequenzierungsbasierte Methode zum Screening von Keimbahn-Edits bei F0-injizierten männlichen Zebrafischen10. Obwohl dieser Ansatz für die Identifizierung der in der Keimbahn vorhandenen mutierten Allele nützlich ist, kann er im Hochdurchsatz kostspielig werden und ist möglicherweise nicht für alle Labore zugänglich. Im Gegensatz dazu bietet das aktuelle Protokoll eine zugängliche und kostengünstige elektrophoresebasierte Strategie zur Identifizierung von Keimbahn-Editierungen. Konkret beschreibt dieses Protokoll eine robuste Methode zum Screening und zur Isolierung von Keimbahnmutationen an bestimmten Loci mittels hochauflösender Agarose-Gelelektrophorese. Darüber hinaus beschreibt dieses Protokoll eine ähnliche Strategie zur Identifizierung der erfolgreichen Integration eines Spenderkonstrukts, das spezifische Bearbeitungen enthält. Wie immer, wenn bestimmte Bearbeitungen gewünscht werden, können sequenzierungsbasierte Strategien zusammen mit dem unten beschriebenen Protokoll durchgeführt werden. Obwohl dieses Protokoll spezifisch für das Zebrafisch-Modellsystem ist, sollten diese Prinzipien auf jedes Modell übertragbar sein, in dem die Entnahme von Spermien ein Routineverfahren ist. Zusammen ermöglichen diese Strategien die Identifizierung von F0-injizierten Männchen mit Keimbahn-Indels/Editits, die nach Standard-Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und/oder Restriktionsverdauung auf einem Gel aufgelöst werden können.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur schnellen Charakterisierung von mutmaßlichen Genomänderungen oder gezielten Mutationen mit Hilfe der CRISPR-Cas-Technologie durch gezielte Analyse von F0-männlichen Spermiengenomen. Dieses Protokoll sollte für andere Tiermodelle zugänglich sein, bei denen Spermien ohne Euthanasie leicht für die Probenahme zur Verfügung stehen. Diese Methode erhöht den Durchsatz beim Screening auf gewünschte Bearbeitungen und ist besonders nützlich für die Identifizierung seltener HD…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Anna Hindes von der Washington University School of Medicine für ihre anfänglichen Bemühungen, mit der Hot-Shot-Methode genomische DNA von Spermien in guter Qualität zu erhalten. Diese Arbeit wurde vom National Institute of Arthritis and Muskuloskeletal and Skin Diseases der National Institutes of Health unter Auszeichnung (R01AR072009 an R.S.G.) finanziert.
Materials
| Agarose powder | Fisher BioReagents | BP1356-100 | |
| Breeding tanks | Carolina Biological | 161937 | |
| BstNI Restriction Enzyme | NEB | R0168S | |
| Cas9 Endonuclease | IDT | 1081060 | |
| DNA Ladder, 100 bp | Thermo Scientific | FERSM0241 | |
| dnah10 donor construct | Sigma-Aldrich | DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry. Phosphorothioate bond on the donor at the first three phosphate bonds on both the 5’ and 3’ ends (5'-CCTCTCTCCCTTTCAGAAGCTTC TGCTCATCCGCTGCTTCTGCCT GGACCGAGTGTACCGTGCCGTC AGTGATTACGTCACGC-3') |
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| dnah10 forward primer | Sigma-Aldrich | DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry (5'-CATGGAACTCTTTCCTAATGAGT TTGGC-3') |
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| dnah10 reverse primer | Sigma-Aldrich | DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry ('5-AGTAGAGATCACACATCAACAGA ATACAGC-3') |
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| dnah10 synthetic sgRNA | Synthego | Synthetic sgRNA, target sequence: 5'-GCTCATCCGCTGCTTCAGGC-3' | |
| Electrophoresis power supply | Thermo Scientific | 105ECA-115 | |
| Filter forceps | Millipore | XX6200006P | |
| Fish (system) water | Generic | n/a | |
| Gel electrophoresis system (including casting frame, comb, and electrophoresis chamber) | Thermo Scientific | B2 | |
| Gel imaging light box | Azure Biosystems | AZI200-01 | |
| Gel stain, 10000X | Invitrogen | S33102 | |
| Glass bowl, 250 mL | Generic | n/a | |
| Isolation tanks, 0.8 L | Aquaneering | ZT080 | |
| Microcap capillary tube with bulb, 20 µL | Drummond | 1-000-0020/CA | |
| Minicentrifuge | Bio-Rad | 12011919EDU | |
| Micropipettes, various with appropriate tips | Generic | n/a | |
| Microwave | Generic | n/a | |
| Nuclease free water | Promega | P119-C | |
| Paper towels | Generic | n/a | |
| PCR tubes, 0.2 mL | Bioexpress | T-3196-1 | |
| Plastic spoon, with drilled holes/slots | Generic | n/a | |
| KCl solution, 0.2 M RNAse Free | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| p2ry12 forward primer | Sigma-Aldrich | DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry (5'-CCCAAATGTAATCCTGACCAGT -3') |
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| p2ry12 reverse primer | Sigma-Aldrich | DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry (5'-CCAGGAACACATTAACCTGGAT -3') |
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| p2ry12 synthetic sgRNA | Synthego | Synthetic sgRNA, target sequence: 5'-GGCCGCACGAGGTCTCCGCG-3' | |
| Restriction Enzyme 10X Buffer | NEB | B6003SVIAL | |
| NaOH solution, 50 mM | Thermo Scientific | S318; 424330010 | |
| Sponge, 1-inch x 1-inch cut with small oval divot | Generic | n/a | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi 508 | |
| Taq polymerase master mix, 2X | Promega | M7122 | |
| TBE Buffer Concentrate, 10X | VWR | E442 | |
| Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | |
| Tissue paper | Fisher Scientific | 06-666 | |
| Tricaine-methanesulfonate solution (Syncaine, MS-222), 0.016% in fish water (pH 7.0±0.2) | Syndel | 200-266 | |
| Tris Base, 1M (Buffered with HCl to ph 8.0) | Promega | H5131 |
Riferimenti
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