筛选精子以快速分离斑马鱼的种系编辑
Summary
CRISPR-Cas技术彻底改变了基因组编辑领域。然而，寻找和分离所需的种系编辑仍然是一个主要瓶颈。因此，该协议描述了一种使用标准PCR，限制性酶切和凝胶电泳技术快速筛选F0 CRISPR注射斑马鱼精子以进行种系编辑的稳健方法。
Abstract
靶向CRISPR-Cas核酸酶技术的出现彻底改变了在已建立和新兴模型系统中进行精确基因组编辑的能力。CRISPR-Cas基因组编辑系统使用合成向导RNA（sgRNA）将CRISPR相关（Cas）核酸内切酶靶向特定的基因组DNA位点，其中Cas核酸内切酶产生双链断裂。通过固有的容易出错机制修复双链断裂会导致插入和/或删除，从而破坏位点。或者，在此过程中包含双链DNA供体或单链DNA寡核苷酸可以引发精确的基因组编辑，范围从单核苷酸多态性到小免疫标签甚至大荧光蛋白构建体。然而，这个过程的一个主要瓶颈可能是在种系中发现和分离所需的编辑。该协议概述了一种在 Danio rerio （斑马鱼）的特定位点筛选和分离种系突变的可靠方法;然而，这些原则可能适用于任何可以 体内精子收集 的模型。
Introduction
CRISPR（簇状规则间隔短回文重复序列）/Cas系统是在Danio rerio（斑马鱼）模型系统1，2，3，4中进行位点特异性诱变和精确基因组编辑的强大工具。Cas-核糖核蛋白 （RNP） 由两种主要成分组成：Cas核酸内切酶（通常为 Cas9 或 Cas12a）和位点特异性合成向导 RNA （sgRNA）5。Cas-RNP一起在所需的位点中产生双链断裂（DSB），可以通过两种内在修复机制之一进行修复。非同源端接 （NHEJ） 修复机制容易出错，并且通常会导致 DSB 周围的各种插入或缺失 （插入缺失）。如果这些插入缺失在所得蛋白质序列中引入移码突变或过早停止，则可能是有害的。或者，同源定向修复 （HDR） 机制使用供体模板，在 DSB 位点周围具有同源区域来修复损伤。研究人员可以利用HDR系统生成精确的基因组编辑。具体来说，他们可以共同注入双链DNA供体构建体，其中包含所需的编辑以及基因组中DSB位点两侧的同源区域。这些商业生产的CRISPR组件的规模经济的提高大大减少了筛选多个位点和为精确基因组编辑建立更大规模努力的障碍。然而，在有性繁殖动物模型中，一个主要瓶颈是种系稳定的突变动物的鉴定和分离。
斑马鱼模型系统表现出几个关键品质，可以增强其在反向遗传研究中的使用。它们很容易通过基本的水生住房设备大量饲养，雌性全年表现出很高的繁殖力6。此外，它们的外部产卵和受精使它们适合显微注射CRISPR / Cas成分。Cas-RNP通常被注射到单细胞阶段斑马鱼胚胎中以产生DSB/修复，理论上，DSBs由所有子细胞遗传。然而，二倍体基因组需要两个DSB/修复事件来诱变两个同源染色体。此外，尽管Cas-RNP是在单细胞阶段注射的，但DSB/修复可能要到发育的后期才会发生。这些因素共同促成了注入F0的鱼的马赛克性质。一种常见的做法是杂交F0注入的鱼，并筛选F1后代的插入/特定编辑。然而，由于并非所有注射F0的鱼都具有种系突变，这种做法会导致许多非生产性杂交，无法产生所需的编辑。筛选F0种系而不是F1体细胞组织增加了分离所需种系编辑的可能性，并减少了该过程所需的动物数量。
精子可以很容易地从注射F0的斑马鱼中收集，而无需安乐死。此功能允许冷冻保存和再衍生冷冻精子原种7 ，但也可用于快速筛选，鉴定和分离所需基因组突变的种系携带者8，9。Brocal等人（2016）之前描述了一种基于测序的方法，用于筛选注射F0的雄性斑马鱼10的种系编辑。虽然这种方法可用于鉴定种系中存在的突变等位基因，但在高通量下可能会变得昂贵，并且可能不适用于所有实验室。相比之下，目前的协议提供了一种平易近人且具有成本效益的基于电泳的策略来鉴定种系编辑。具体来说，该协议概述了使用高分辨率琼脂糖凝胶电泳筛选和分离特定位点种系突变的稳健方法。此外，该协议描述了一种类似的策略，用于识别包含特定编辑的供体构建体的成功整合。与往常一样，如果需要特定的编辑，可以与下面描述的协议一起执行基于测序的策略。尽管该协议特定于斑马鱼模型系统，但这些原则应适用于任何将精子收集作为常规程序的模型。总之，这些策略将允许鉴定具有种系插入缺失/编辑的F0注射雄性，这些插入缺失/编辑可以在标准聚合酶链反应（PCR）和/或限制性酶切后在凝胶上解决。
Protocol
Representative Results
Discussion
该协议描述了一种通过聚焦分析F0男性精子基因组，使用CRISPR-Cas技术快速表征假定基因组编辑或靶向突变的方法。该协议应适用于其他动物模型，其中精子很容易采样而无需安乐死。这种方法将提高筛选所需编辑的吞吐量，对于识别罕见的 HDR 介导的敲入事件特别有用。这种方法还有助于减少用于寻找稳定种系编辑的实验动物的数量，通过促进从推定的F0载体中快速筛选一个精子样本中潜在的数千…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们要感谢华盛顿大学医学院的Anna Hindes，感谢她使用热射法获得高质量精子基因组DNA的初步努力。这项工作由美国国立卫生研究院国家关节炎，肌肉骨骼和皮肤病研究所资助（R01AR072009至RSG）。
Materials
| Agarose powder | Fisher BioReagents | BP1356-100 | |
| Breeding tanks | Carolina Biological | 161937 | |
| BstNI Restriction Enzyme | NEB | R0168S | |
| Cas9 Endonuclease | IDT | 1081060 | |
| DNA Ladder, 100 bp | Thermo Scientific | FERSM0241 | |
| dnah10 donor construct | Sigma-Aldrich | DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry. Phosphorothioate bond on the donor at the first three phosphate bonds on both the 5’ and 3’ ends (5'-CCTCTCTCCCTTTCAGAAGCTTC TGCTCATCCGCTGCTTCTGCCT GGACCGAGTGTACCGTGCCGTC AGTGATTACGTCACGC-3') |
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| dnah10 forward primer | Sigma-Aldrich | DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry (5'-CATGGAACTCTTTCCTAATGAGT TTGGC-3') |
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| dnah10 reverse primer | Sigma-Aldrich | DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry ('5-AGTAGAGATCACACATCAACAGA ATACAGC-3') |
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| dnah10 synthetic sgRNA | Synthego | Synthetic sgRNA, target sequence: 5'-GCTCATCCGCTGCTTCAGGC-3' | |
| Electrophoresis power supply | Thermo Scientific | 105ECA-115 | |
| Filter forceps | Millipore | XX6200006P | |
| Fish (system) water | Generic | n/a | |
| Gel electrophoresis system (including casting frame, comb, and electrophoresis chamber) | Thermo Scientific | B2 | |
| Gel imaging light box | Azure Biosystems | AZI200-01 | |
| Gel stain, 10000X | Invitrogen | S33102 | |
| Glass bowl, 250 mL | Generic | n/a | |
| Isolation tanks, 0.8 L | Aquaneering | ZT080 | |
| Microcap capillary tube with bulb, 20 µL | Drummond | 1-000-0020/CA | |
| Minicentrifuge | Bio-Rad | 12011919EDU | |
| Micropipettes, various with appropriate tips | Generic | n/a | |
| Microwave | Generic | n/a | |
| Nuclease free water | Promega | P119-C | |
| Paper towels | Generic | n/a | |
| PCR tubes, 0.2 mL | Bioexpress | T-3196-1 | |
| Plastic spoon, with drilled holes/slots | Generic | n/a | |
| KCl solution, 0.2 M RNAse Free | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| p2ry12 forward primer | Sigma-Aldrich | DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry (5'-CCCAAATGTAATCCTGACCAGT -3') |
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| p2ry12 reverse primer | Sigma-Aldrich | DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry (5'-CCAGGAACACATTAACCTGGAT -3') |
|
| p2ry12 synthetic sgRNA | Synthego | Synthetic sgRNA, target sequence: 5'-GGCCGCACGAGGTCTCCGCG-3' | |
| Restriction Enzyme 10X Buffer | NEB | B6003SVIAL | |
| NaOH solution, 50 mM | Thermo Scientific | S318; 424330010 | |
| Sponge, 1-inch x 1-inch cut with small oval divot | Generic | n/a | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi 508 | |
| Taq polymerase master mix, 2X | Promega | M7122 | |
| TBE Buffer Concentrate, 10X | VWR | E442 | |
| Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | |
| Tissue paper | Fisher Scientific | 06-666 | |
| Tricaine-methanesulfonate solution (Syncaine, MS-222), 0.016% in fish water (pH 7.0±0.2) | Syndel | 200-266 | |
| Tris Base, 1M (Buffered with HCl to ph 8.0) | Promega | H5131 |
Riferimenti
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