Her præsenteres en protokol til implementering af ekspansionsmikroskopi i tidlige Drosophila-embryoner for at opnå superopløsningsbilleddannelse ved hjælp af et konventionelt laserscanningskonfokalmikroskop.
Arbejdshesten i udviklingsbiologi er det konfokale mikroskop, som gør det muligt for forskere at bestemme den tredimensionelle lokalisering af mærkede molekyler inden for komplekse biologiske prøver. Mens traditionelle konfokale mikroskoper gør det muligt at løse to tilstødende fluorescerende punktkilder, der ligger et par hundrede nanometer fra hinanden, kræver iagttagelse af de finere detaljer i subcellulær biologi evnen til at løse signaler i størrelsesordenen snesevis af nanometer. Talrige hardwarebaserede metoder til superopløsningsmikroskopi er blevet udviklet for at give forskere mulighed for at omgå sådanne opløsningsgrænser, selvom disse metoder kræver specialiserede mikroskoper, der ikke er tilgængelige for alle forskere. En alternativ metode til at øge opløsningsevnen er isotropisk at forstørre selve prøven gennem en proces kendt som ekspansionsmikroskopi (ExM), som først blev beskrevet af Boyden-gruppen i 2015. ExM er ikke en type mikroskopi i sig selv , men er snarere en metode til hævelse af en prøve, samtidig med at den relative rumlige organisering af dens bestanddele bevares. Den udvidede prøve kan derefter observeres ved en effektivt øget opløsning ved hjælp af et traditionelt konfokalmikroskop. Her beskriver vi en protokol til implementering af ExM i helmonterede Drosophila-embryoner , som bruges til at undersøge lokaliseringen af Par-3, myosin II og mitokondrier inden for overfladeepitelcellerne. Denne protokol giver en ca. fire gange stigning i prøvestørrelse, hvilket muliggør påvisning af subcellulære detaljer, der ikke er synlige med konventionel konfokal mikroskopi. Som bevis på princippet anvendes et anti-GFP-antistof til at skelne forskellige puljer af myosin-GFP mellem tilstødende cellekortika, og fluorescerende mærket streptavidin bruges til at detektere endogene biotinylerede molekyler for at afsløre de fine detaljer i mitokondrienetværksarkitekturen. Denne protokol anvender almindelige antistoffer og reagenser til fluorescensmærkning, og den skal være kompatibel med mange eksisterende immunfluorescensprotokoller.
I celle- og udviklingsbiologi er det at se at tro, og evnen til nøjagtigt at bestemme lokaliseringsmønstre for proteiner er grundlæggende for mange typer eksperimenter. Laserscanning konfokal mikroskopi er standardværktøjet til billeddannelse af fluorescerende mærkede proteiner i tre dimensioner inden for intakte prøver. Konventionelle konfokale mikroskoper er ude af stand til at skelne (opløse) tilstødende fluorescerende signaler, der adskilles med mindre end halvdelen af bølgelængden af det lys, de udsender1. Med andre ord skal to punktkilder adskilles med mindst 200-300 nm i lateral retning (500-700 nm i aksial retning) for at løse dem som to forskellige signaler. Denne tekniske barriere er kendt som diffraktionsgrænsen, og det er en grundlæggende hindring for undersøgelser af komplekse subcellulære strukturer (fx actomyosin cytoskeletale eller mitokondrie netværk) med rumlige træk under diffraktionsgrænsen. Derfor er teknikker til at øge opløsningskraften i konventionelle konfokale mikroskoper af almen interesse for det biologiske samfund.
For at omgå diffraktionsgrænsen er der udviklet en række forskellige superopløsningsmikroskopiteknologier, der muliggør opløsning i størrelsesordenen snesevis af nanometer eller mindre 1,2,3, hvilket afslører en verden af biologisk kompleksitet, der tidligere kun var tilgængelig via elektronmikroskopi. På trods af de åbenlyse fordele ved disse hardwarebaserede metoder har superopløsningsmikroskoper ofte specifikke prøvemærkningskrav og lange anskaffelsestider, hvilket begrænser deres fleksibilitet, eller de kan simpelthen være for dyre for nogle laboratorier at få adgang til. Et alternativ til mikroskopbaseret superopløsning er ekspansionsmikroskopi (ExM), som ikke er en type mikroskopi i sig selv, men snarere er en metode til hævelse af en prøve, samtidig med at den relative rumlige organisering af dens bestanddelebevares 4. De isotropisk udvidede prøver kan derefter observeres ved en effektivt øget opløsning ved anvendelse af et traditionelt fluorescenskonfokalmikroskop. ExM blev først beskrevet af Boyden-gruppen i 20155, og grundteknikken er siden blevet tilpasset til brug i en række eksperimenter 6,7,8. ExM er også blevet tilpasset til brug i helmonterede embryoner, især i Drosophila 9,10,11, C. elegans12 og zebrafisk 13, hvilket gør det til et kraftfuldt værktøj for udviklingsbiologer.
ExM er baseret på to forskellige hydrogelkemikalier: 1) opsvulmelige polyelektrolythydrogeler, som stiger kraftigt i størrelse, når de gennemblødes i vand14, og 2) polyacrylamidhydrogeler, som har ekstremt lille polymerafstand for at muliggøre isotrop prøveudvidelse15. Selvom der er mange offentliggjorte ExM-protokoller, deler de generelt følgende trin: prøvefiksering, mærkning, aktivering, gelering, fordøjelse og ekspansion4. Fikseringsbetingelserne og fluorescensmærkningsstrategierne vil naturligvis variere afhængigt af eksperimentets og systemets behov, og i nogle protokoller sker mærkning efter udvidelse. Målmolekylerne i prøven skal grundes (aktiveres) til binding til hydrogelen, hvilket kan opnås ved hjælp af forskellige kemikalier4. Under geleringstrinnene er prøven mættet med monomerer af den fremtidige hydrogel (natriumacrylat, acrylamid og tværbindingsbisacrylamid), og hydrogelen dannes derefter ved fri radikalpolymerisation katalyseret af en initiator, såsom ammoniumpersulfat (APS) og en accelerator, såsom tetramethylendiamin (TEMED)4. Efter gelering fordøjes prøven enzymatisk for at homogenisere prøvens modstandsdygtighed over for hævelse og sikre den isotrope ekspansion af hydrogelen4. Endelig placeres den fordøjede hydrogel i vand, hvilket får den til at udvide sig til ca. fire gange sin oprindelige lineære størrelse4.
Figur 1: Oversigt over ekspansionsmikroskopi i Drosophila-embryoner . ExM er en flertrinsprotokol, der tager mindst 4 dage at gennemføre. Embryoindsamling, fiksering og devitellinisering tager 1 dag eller mere afhængigt af om embryoner fra flere samlinger samles. Immunofluorescensmærkning tager 1 dag eller 2 dage afhængigt af om embryonerne inkuberes natten over med de primære antistoffer. Embryoaktivering, gelering, fordøjelse og ekspansion kan udføres på en enkelt dag. Gelerne kan monteres og afbildes umiddelbart efter ekspansion, selvom det af praktiske årsager ofte er ønskeligt at starte billeddannelsen den følgende dag. Klik her for at se en større version af denne figur.
Denne protokol beskriver, hvordan man udfører ExM på helmonterede tidlige til mellemste fase Drosophila-embryoner 16 for at visualisere subcellulære proteinlokaliseringsmønstre ved superopløsning (figur 1). Denne metode bruger methylacrylsyre N-hydroxysuccinimidylester (MA-NHS) kemi til at aktivere og forankre proteinmolekyler til hydrogelen 17, og det er en modifikation af en tidligere offentliggjort ExM-protokol til brug i sene stadier og væv11. Denne protokol bruger polydimethylsiloxan (PDMS) brønde til at forme hydrogelerne og lette opløsningsudveksling under aktivering og gelering. En alternativ metode, der ikke kræver oprettelse af PDMS-brønde, indebærer sænkning af embryoner, der er fastgjort til dæksedler, i dråber monomeropløsning, der sidder på et stykke laboratorieforseglingsfilm22. Derudover beskriver denne protokol en metode til manuelt at fjerne den uigennemtrængelige vitellinmembran, der omgiver Drosophila-embryoner, hvilket er en forudsætning for immunofluorescensfarvning. Det er vigtigt, at denne metode til håndskrælning af embryoner kun kan bruges til at vælge korrekt iscenesatte Drosophila-embryoner inden prøvemærkning, hvilket i høj grad øger sandsynligheden for at ende med udvidede prøver af det korrekte stadium og orientering og dermed gør downstream-dataindsamlingen meget mere effektiv.
Manuel devitellinisering
De fleste Drosophila embryofikseringsprotokoller involverer fjernelse af vitellinmembranen ved at ryste faste embryoner i en emulsion af methanol og heptan, hvilket får membranerne til at sprænge via osmotisk brud26. Mens methanolbaseret devitellinisering (methanolpopping) er effektiv og passende til mange applikationer, giver manuel devitellinisering (håndskrælning) nogle væsentlige fordele. For det første giver håndskrælning mulighed for at vælge præcist iscenesatte embryoner til at afvige og indsamle, hvilket i høj grad øger sandsynligheden for at opnå udvidede embryoner i en brugbar orientering ved eksperimentets afslutning. Denne berigelse er kritisk, når man studerer specifikke aspekter af hurtige udviklingsprocesser (f.eks. Mesoderm invagination eller konvergent forlængelse), for hvilke passende iscenesatte embryoner kun kan repræsentere nogle få procent af alle embryoner, selv inden for et stramt timet indsamlingsvindue. Selvfølgelig vil den mere traditionelle bulk-methanolpopping af embryoner fra et tidsindstillet opsamlingsvindue være tilstrækkelig til mange applikationer, og håndskrælning er muligvis ikke den ekstra indsats værd. For det andet påvirkes bindingen af visse primære antistoffer og farvestoffer negativt af prøvens tidligere eksponering for methanol. Af denne grund kan håndskrælning give betydelige stigninger i immunofluorescenssignalkvaliteten sammenlignet med methanol-poppede prøver, hvilket gør det til en nyttig generel teknik for Drosophila-udviklingsbiologer .
Konfokalmikroskopi med høj opløsning i udvidede helmonterede Drosophila-embryoner
Mens udførelse af konfokalmikroskopi med høj opløsning på udvidede prøver konceptuelt er det samme som på uudvidede prøver, introducerer ExM nogle tekniske forhindringer. Især embryoorientering, som er tilfældig, bliver endnu vigtigere, efterhånden som prøvestørrelsen øges, fordi høje forstørrelsesmål med høj NA kun er i stand til at fokusere lys fra prøveområder, der er meget tæt på dæksel27. Derfor er det normalt kun muligt at fokusere på cellerne på eller nær overfladen af embryoet, der endte ved siden af dæksedlen, da gelen blev dannet. Den bedste måde at sikre, at der er prøver med den korrekte retning i slutningen, er at starte ExM-protokollen med en tæt iscenesat samling af faste embryoner (f.eks. ved hjælp af håndskrælning) og at frø mange embryoner i hver brønd (>10). For at visualisere celler dybt inde i embryoet kan det være nødvendigt at bruge mere specialiserede billeddannelsesopsætninger, såsom lysarkmikroskopi28. Derudover finder vi, at billedkvaliteten kan forbedres ved at åbne det konfokale pinhole til en størrelse større end en luftig enhed. Selvfølgelig vil en øget pinhole størrelse komme på bekostning af nedsat maksimal opløsning, men i praksis kan selv små stigninger i pinhole størrelse øge signalintensiteten betydeligt (data ikke vist). Fremtidige undersøgelser bør systematisk behandle pinhole størrelse og effektiv opløsning i ExM-prøver.
Variationer på grundlæggende ExM
Protokollen beskrevet her er et relativt simpelt eksempel på ExM, der skal fungere til mange applikationer og være let at implementere i de fleste udviklingsbiologiske laboratorier. Der er dog adskillige variationer af det grundlæggende koncept for ExM 4,5,7, der kan bruges til at øge signalintensiteten, opnå endnu flere grader af ekspansion og detektere nukleinsyremolekyler såvel som proteiner. I denne protokol inkuberes embryonerne med antistoffer før gelering og ekspansion. Alternativt kan prøverne behandles med antistoffer, efter at de er udvidet 6,30, hvilket kan øge signalintensiteten på grund af øget epitoptilgængelighed og nedsat tab af bundne antistoffer under ekspansionstrinnene. Derudover kan specifikke tværbindingsmolekyler anvendes til at binde RNA-molekyler til hydrogelen for at tillade påvisning af RNA i ekspanderede geler ved anvendelse af hybridiseringskædereaktionsmetode30. Endelig kan prøverne udsættes for flere ekspansionsrunder, som i iterativ ekspansionsmikroskopi (iExM)31, pan-ExM32 og ekspansionsafslørende (ExR)31, for at opnå endnu højere grader af øget opløsning.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne takke Dr. Jennifer Zallen for at levere marsvinets anti-Par-3 primære antistof. Dette arbejde blev støttet af generøs finansiering (1R15GM143729-01 og 1P20GM139768-01 5743) fra National Institute of General Medical Science (NIGMS), et af medlemmerne af National Institutes of Health (NIH), samt Arkansas Biosciences Institute (ABI), som gav delvis finansiering til køb af vores konfokale mikroskop.
acrylamide | Milipore Sigma | 1490-100ML | |
ammonium persulfate | VWR | BDH9214-500G | |
anti-GFP rabbit polyclonal antibody | Torrey Pines BioLabs | TP-401 | |
anti-guinea pig IgG goat polyclonal antibody, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A-11075 | |
anti-rabbit IgG goat polyclonal antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11008 | |
bisacrylamide | Research Products International | A11275 | |
bovine serum albumin (30% solution) | Millipore Sigma | A7284 | |
conical tubes, 50 mL | fisherscientific | 21008-940 | |
coverlip glass, square 22 mm | VWR | 48366-227 | |
coverslip glass, rectangular 40 mm x 24 mm | VWR | 48393-230 | |
glass capillaries for pulling needles | World Precision Instruments | TW100F-4 | |
glass microinjection needles (pre-pulled) | World Precision Instruments | TIP10LT | |
guanidine HCl | VWR | 101970-606 | |
heptane | VWR | EM-HX0078-1 | |
latex pipet bulbs | VWR | 82024-554 | |
methanol | VWR | BDH1135-4LP | |
methylacylic acid N-hydroxysuccinimidyl ester | VWR | 730300-1G | |
microfuge tube, 1.5 mL | VWR | 20170-038 | |
multi-well plate, 6-well | Genesee | 25-100 | |
paraformaldehyde (16%, EM-grade, methanol-free) | Electron Microscopy Sciences | 509804487 (Fisher) | |
Pasteur pipet (2 mL, short tip) | VWR | 14673-010 | |
PDMS kit (Sylgard 184 Kit, base and curing agent) | VWR | 102092-312 | |
Petri plates | Genesee | 32-107 | |
phosphate-buffered saline (10x solution) | VWR | 97063-660 | |
Poly-L-lysine solution (0.1% solution) | VWR | P8920-1ooML | |
Proteinase K | Thermo Fisher Scientific | E00491 | |
scintillation vials (30 mL) | VWR | 66022-128 | |
sodium acrylate | VWR | 101181-226 | |
sodium azide (powder) | Millipore Sigma | 71289 | make a 1% w/v working stock; acute POISON at this concentration! |
Streptavidin, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | S32354 | |
TAE (50x) | VWR | 97063-692 | |
tape (double-sided, 1 inch wide) | Scotch 3M | 665 Scotch double sided 1inch/1296 inches Boxed | |
TEMED | Thermo Fisher Scientific | PI17919 | |
TEMPO | VWR | EM8.14681.0005 | catalytic oxidant |
Tween-20 | VWR | 97063-872 | extremely viscous when pure; make a 10% working stock with water |
Zeiss LSM 900 | Zeiss | Laser scanning microscope used without AiryScan |