Быстрый, простой и стандартизированный метод гомогенизации для получения антигенных / адъювантных эмульсий для индуцирования экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита
Summary
Чтобы вызвать экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит, животную модель рассеянного склероза, мышей иммунизируют эмульсией «вода в масле», содержащей аутоантиген и полный адъювант Фройнда. Хотя для приготовления этих эмульсий существует несколько протоколов, здесь представлен быстрый, простой и стандартизированный протокол гомогенизации для получения эмульсии.
Abstract
Экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (EAE) имеет сходные иммунологические и клинические особенности с рассеянным склерозом (РС) и поэтому широко используется в качестве модели для определения новых лекарственных мишеней для лучшего лечения пациентов. РС характеризуется несколькими различными течениями заболевания: рецидивирующе-ремиттирующий РС (РРМС), первично-прогрессирующий РС (ППМС), вторичный прогрессирующий РС (СПМС) и редкая прогрессирующая рецидивирующая форма РС (ПРМС). Хотя животные модели не точно имитируют все эти контрастные фенотипы заболеваний человека, существуют модели EAE, которые отражают некоторые из различных клинических проявлений РС. Например, миелиновый олигодендроцитарный гликопротеин (MOG), индуцированный EAE у мышей C57BL/6J, имитирует человеческую PPMS, в то время как миелиновый протеолипидный белок (PLP), индуцированный EAE у мышей SJL / J, напоминает RRMS. Другие аутоантигены, такие как основной белок миелина (MBP), и ряд различных штаммов мышей также используются для изучения EAE. Чтобы вызвать заболевание в этих аутоантигенно-иммунизационных моделях EAE, готовят эмульсию «вода в масле» и вводят подкожно. Большинство моделей EAE также требуют инъекции коклюшного токсина для развития заболевания. Для последовательной и воспроизводимой индукции EAE необходим подробный протокол подготовки реагентов к получению эмульсий антигена/адъюванта. Метод, описанный здесь, использует преимущества стандартизированного метода для получения эмульсий «вода в масле». Он прост и быстр и использует встряхивающий гомогенизатор вместо шприцев для приготовления эмульсий с контролируемым качеством.
Introduction
Нарушение иммунологической толерантности может привести к генерации аутоиммунных расстройств, таких как рассеянный склероз (РС). По оценкам, 2,8 миллиона человек живут с РС во всем мире1. Хотя точная причина РС до сих пор в значительной степени неизвестна, дисрегуляция аутореактивных Т- и В-клеток, а также дефекты функции Treg играют важную роль в патогенезе заболевания 2,3.
Животные модели аутоиммунных заболеваний являются важными инструментами для исследования потенциальных терапевтических методов. Экспериментальная модель аутоиммунного энцефаломиелита (EAE) используется в течение почти столетия исследователями, заинтересованными в MS4. В ранних экспериментах заболеваемость была относительно низкой. Введение полного адъюванта Фройнда (CFA), содержащего микобактерии и токсин коклюша, позволило последовательно индукционировать EAE у мышей4. Самое главное, необходимо смешать CFA с антигеном, специфичным для центральной нервной системы (ЦНС), чтобы получить однородную эмульсию «вода в масле» для индуцирования EAE. Наиболее распространенные в настоящее время модели EAE основаны на активной иммунизации мышей энцефалогенными пептидами. Генетический фон мышей играет важную роль в восприимчивости к заболеванию, причем пептиды миелин-олигодендроцитарных гликопротеинов (MOG35-55) и протеолипидного белка миелина (PLP139-151) используются для индуцирования EAE у мышей C57BL/6J и SJL соответственно5. Тем не менее, другие мышиные штаммы и пептиды, полученные из ЦНС, также могут быть использованы.
Качество CFA/пептидной эмульсии является критическим фактором, определяющим пенетрантность заболевания в активной иммунизации EAE model6. Гомогенная эмульсия «вода в масле» должна быть получена путем смешивания энцефалтогенных пептидов, растворенных в водном буфере с CFA, иначе у животных не разовьется болезнь. Были опубликованы многочисленные протоколы по приготовлению CFA/пептидных эмульсий. Примеры включают использование вихря7, обработки ультразвуком8, шприцев и трехстороннего Т-образного разъема9 или одного шприца только5. Однако все эти методы трудно стандартизировать и часто связаны с длинными и сложными протоколами.
По сравнению со всеми вышеперечисленными методами, простой метод, описанный здесь для приготовления эмульсии, предлагает преимущества отсутствия различий между людьми и относительно быстроты. Эмульсия генерируется гомогенизатором, встряхивающим реагенты с заданной скоростью, временем и температурой, обеспечивая быстрые и последовательные результаты. В дополнение к индуцированию заболевания в модели EAE, этот метод также может быть использован для изучения других моделей аутоиммунных заболеваний, таких как коллаген-индуцированный артрит (CIA) и антиген-индуцированный артрит (AIA)6. Поэтому предполагается, что этот метод может быть использован для последовательного индуцирования заболевания на других животных моделях, которые зависят от эмульсий «вода в масле» с аутоантигенами, таких как экспериментальный аутоиммунный неврит (EAN)10, экспериментальный аутоиммунный тиреоидит (EAT)11, аутоиммунный увеит (EAU)12 и миастения (MG)13. Этот метод также вызывает общие иммунные реакции, такие как гиперчувствительность замедленного типа (DTH) последовательно6, и поэтому может быть использован для доставки противораковых и малярийных вакцин (см. обсуждение).
Таким образом, разработан и представлен здесь быстрый (общее время приготовления ~30 мин), простой (все реагенты могут быть приготовлены заранее и сохранены) и стандартизированный (эмульсия осуществляется с помощью встряхивающего гомогенизатора) способ. Эмульсии CFA/антигена, приготовленные с использованием этого протокола, последовательно индуцируют заболевание на аутоиммунных животных моделях.
Protocol
Representative Results
Discussion
Эмульсии «вода в масле», такие как антиген / адъювант Фройнда, использовались более полувека для индуцирования EAE17. В настоящее время не существует стандартизированного метода получения антигенных эмульсий, который не зависел бы от влияния человека. Ручное смешивание с ис?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Автор хотел бы выразить признательность подразделениям по содержанию животных в Лундском университете, Камилле Бьорклёв и Агнешке Чопек за их поддержку, а также Ричарду Уильямсу, Институт ревматологии Кеннеди, Оксфордский университет, Великобритания, за конструктивную критику и лингвистическую поддержку при создании этой рукописи.
Materials
| 1 mL Injection syringe | B. Braun | 9166017V | |
| 1 mL Injection syringe | Sigma-Aldrich | Z683531 | |
| 7 ml empty tubes with caps | Bertin-Instruments | P000944LYSK0A.0 | 7 mL tube |
| 50 mL sterile centrifuge tube | Fisher Scientific | 10788561 | 50 mL tube |
| Bordetella pertussis toxin | Sigma-Aldrich | P2980 | Store at -20 °C |
| Dispersant, light mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | Store at RT |
| Emulsion kit | Bertin-Instruments | D34200.10 ea | Containing a tube, cap, and plunger |
| Incomplete Freund's Adjuvant | Sigma-Aldrich | F5506 | Store at +4 °C |
| Mycobacterium tuberculosis, H37RA | Fisher Scientific | DF3114-33-8 | Store at +4 °C |
| Mastersizer 2000 | Malvern Panalytical | N/A | Particle size analyzer |
| Minilys-Personal homogenizer | Bertin-Instruments | P000673-MLYS0-A | Shaking homogenizer |
| MOG 35-55 Peptide | Innovagen | N/A | |
| Montanide ISA 51 VG | Seppic | 36362Z | FDA-approved oil adjuvant |
| Pall Acrodisc Syringe Filters 0.2 μm | Fisher Scientific | 17124381 | Sterlie filter |
| PBS, Ca2+/Mg2+ free | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | PBS |
| Phase-Constrast Microscope | Olympus | BX40-B | |
| Steel Beads 3.2 mm | Fisher Scientific | NC0445832 | Autoclave and store at RT |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 648463 | Store at RT |
Riferimenti
- Walton, C., et al. Rising prevalence of multiple sclerosis worldwide: Insights from the Atlas of MS, third edition. Multiple Sclerosis. 26 (14), 1816-1821 (2020).
- van Langelaar, J., Rijvers, L., Smolders, J., van Luijn, M. M. B and T cells driving multiple sclerosis: identity, mechanisms and potential triggers. Frontiers in Immunology. 11, 760 (2020).
- Sambucci, M., Gargano, F., Guerrera, G., Battistini, L., Borsellino, G. One, No One, and One Hundred Thousand: T Regulatory Cells’ Multiple Identities in Neuroimmunity. Frontiers in Immunology. 10, 2947 (2019).
- Mix, E., Meyer-Rienecker, H., Hartung, H. P., Zettl, U. K. Animal models of multiple sclerosis–potentials and limitations. Progress in Neurobiology. 92 (3), 386-404 (2010).
- Terry, R. L., Ifergan, I., Miller, S. D. Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice. Methods in Molecular Biology. 1304, 145-160 (2016).
- Topping, L. M., et al. Standardization of antigen-emulsion preparations for the induction of autoimmune disease models. Frontiers in Immunology. 13, 892251 (2022).
- Flies, D. B., Chen, L. A simple and rapid vortex method for preparing antigen/adjuvant emulsions for immunization. Journal of Immunological Methods. 276 (1-2), 239-242 (2003).
- Määttä, J. A., Erälinna, J. P., Röyttä, M., Salmi, A. A., Hinkkanen, A. E. Physical state of the neuroantigen in adjuvant emulsions determines encephalitogenic status in the BALB/c mouse. Journal of Immunological Methods. 190 (1), 133-141 (1996).
- Moncada, C., Torres, V., Israel, Y. Simple method for the preparation of antigen emulsions for immunization. Journal of Immunological Methods. 162 (1), 133-140 (1993).
- Waksman, B. H., Adams, R. D. Allergic neuritis: an experimental disease of rabbits induced by the injection of peripheral nervous tissue and adjuvants. The Journal of Experimental Medicine. 102 (2), 213-236 (1955).
- Vladutiu, A. O., Rose, N. R. Autoimmune murine thyroiditis relation to histocompatibility (H-2) type. Science. 174 (4014), 1137-1139 (1971).
- Caspi, R. R. Experimental autoimmune uveoretinitis in the rat and mouse. Current Protocols in Immunology. , (2003).
- Tuzun, E., et al. Guidelines for standard preclinical experiments in the mouse model of myasthenia gravis induced by acetylcholine receptor immunization. Experimental Neurology. 270, 11-17 (2015).
- Brinckerhoff, L. H., et al. Terminal modifications inhibit proteolytic degradation of an immunogenic MART-1(27-35) peptide: implications for peptide vaccines. International Journal of Cancer. 83 (3), 326-334 (1999).
- Kool, M., et al. Alum adjuvant boosts adaptive immunity by inducing uric acid and activating inflammatory dendritic cells. The Journal of Experimental Medicine. 205 (4), 869-882 (2008).
- Hasselmann, J. P. C., Karim, H., Khalaj, A. J., Ghosh, S., Tiwari-Woodruff, S. K. Consistent induction of chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in C57BL/6 mice for the longitudinal study of pathology and repair. Journal of Neuroscience Methods. 284, 71-84 (2017).
- Freund, J., Lipton, M. M. Experimental allergic encephalomyelitis after the excision of the injection site of antigen-adjuvant emulsion. The Journal of Immunology. 75 (6), 454-459 (1955).
- Stromnes, I. M., Goverman, J. M. Active induction of experimental allergic encephalomyelitis. Nature Protocols. 1 (4), 1810-1819 (2006).
- Shaw, M. K., Zhao, X. Q., Tse, H. Y. Overcoming unresponsiveness in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) resistant mouse strains by adoptive transfer and antigenic challenge. Journal of Visualized Experiments. (62), e3778 (2012).
- Arevalo-Herrera, M., et al. Randomized clinical trial to assess the protective efficacy of a Plasmodium vivax CS synthetic vaccine. Nature Communications. 13 (1), 1603 (2022).
- Jiang, C., et al. Potential association factors for developing effective peptide-based cancer vaccines. Frontiers in Immunology. 13, 931612 (2022).
- Neninger Vinageras, E., et al. Phase II randomized controlled trial of an epidermal growth factor vaccine in advanced non-small-cell lung cancer. Journal of Clinical Oncology. 26 (9), 1452-1458 (2008).
