Un metodo di omogeneizzazione rapido, semplice e standardizzato per preparare emulsioni antigene/adiuvanti per indurre l'encefalomielite autoimmune sperimentale
Summary
Per indurre l’encefalomielite autoimmune sperimentale, un modello animale di sclerosi multipla, i topi vengono immunizzati con un’emulsione acqua-in-olio contenente un autoantigene e un adiuvante completo di Freund. Mentre esistono diversi protocolli per la preparazione di queste emulsioni, qui viene presentato un protocollo di omogeneizzazione rapido, semplice e standardizzato per la preparazione dell’emulsione.
Abstract
L’encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) condivide caratteristiche immunologiche e cliniche simili alla sclerosi multipla (SM) ed è quindi ampiamente utilizzata come modello per identificare nuovi bersagli farmacologici per un migliore trattamento del paziente. La SM è caratterizzata da diversi decorsi di malattia: SM recidivante-remittente (SMRR), SM primaria progressiva (SMPP), SM secondaria progressiva (SPMS) e una rara forma progressiva-recidivante di SM (PRMS). Sebbene i modelli animali non imitino accuratamente tutti questi fenotipi contrastanti di malattia umana, ci sono modelli EAE che riflettono alcune delle diverse manifestazioni cliniche della SM. Ad esempio, l’EAE indotto dalla glicoproteina oligodendrocitaria mielina (MOG) nei topi C57BL / 6J imita la SMPP umana, mentre l’EAE indotto dalla proteina proteolipidica della mielina (PLP) nei topi SJL / J assomiglia alla SMRR. Altri autoantigeni, come la proteina basica della mielina (MBP), e un certo numero di diversi ceppi di topo sono anche usati per studiare EAE. Per indurre la malattia in questi modelli EAE di immunizzazione autoantigene, viene preparata e iniettata per via sottocutanea un’emulsione acqua-in-olio. La maggior parte dei modelli EAE richiede anche un’iniezione di tossina della pertosse per lo sviluppo della malattia. Per un’induzione EAE coerente e riproducibile, è necessario un protocollo dettagliato per preparare i reagenti a produrre emulsioni antigene/adiuvante. Il metodo qui descritto si avvale di un metodo standardizzato per generare emulsioni acqua-in-olio. È semplice e veloce e utilizza un omogeneizzatore agitatore al posto delle siringhe per preparare emulsioni di qualità controllata.
Introduction
Una rottura della tolleranza immunologica può provocare la generazione di malattie autoimmuni, come la sclerosi multipla (SM). Si stima che 2,8 milioni di persone convivono con SM in tutto il mondo1. Sebbene la causa esatta della SM sia ancora in gran parte sconosciuta, la disregolazione delle cellule T e B autoreattive, così come i difetti nella funzione Treg, svolgono un ruolo importante nella patogenesi della malattia 2,3.
I modelli animali di malattie autoimmuni sono strumenti essenziali per studiare potenziali modalità terapeutiche. Il modello sperimentale di encefalomielite autoimmune (EAE) è stato utilizzato per quasi un secolo dai ricercatori interessati alla SM4. Nei primi esperimenti, l’incidenza della malattia era relativamente bassa. L’introduzione dell’adiuvante completo di Freund (CFA), contenente Mycobacterium e tossina della pertosse, ha permesso l’induzione coerente di EAE nei topi4. Ancora più importante, è necessario mescolare CFA con un antigene specifico del sistema nervoso centrale (SNC) per generare un’emulsione acqua-in-olio omogenea per indurre EAE. I modelli EAE attualmente disponibili più comuni si basano sull’immunizzazione attiva di topi con peptidi encefalitogeni. Il background genetico dei topi gioca un ruolo importante nella suscettibilità alla malattia, con la glicoproteina oligodendrocitaria mielinica (MOG35-55) e la proteina proteolipidica mielinica (PLP139-151) peptidi utilizzati per indurre EAE nei topi C57BL / 6J e SJL, rispettivamente5. Tuttavia, possono essere utilizzati anche altri ceppi di topo e peptidi derivati dal SNC.
La qualità dell’emulsione CFA/peptide è un fattore critico che determina la penetranza della malattia nell’immunizzazione attiva EAE modello6. Un’emulsione omogenea acqua-in-olio deve essere preparata mescolando i peptidi encefalitogeni disciolti in tampone acquoso con CFA, altrimenti gli animali non svilupperanno la malattia. Sono stati pubblicati numerosi protocolli sulla preparazione di emulsioni CFA/peptidiche. Gli esempi includono l’uso di un vortice7, sonicazione8, siringhe e un connettore T a tre vie9, o una siringa solo5. Tuttavia, tutti questi metodi sono difficili da standardizzare e sono spesso associati a protocolli lunghi e complicati.
Rispetto a tutti i metodi di cui sopra, il semplice metodo qui descritto per la preparazione dell’emulsione offre il vantaggio di non avere differenze da persona a persona e di essere relativamente veloce. L’emulsione viene generata da un omogeneizzatore che agita i reagenti con una velocità, un tempo e una temperatura impostati, garantendo risultati rapidi e coerenti. Oltre a indurre la malattia nel modello EAE, questo metodo può anche essere utilizzato per studiare altri modelli di malattia autoimmune come l’artrite indotta dal collagene (CIA) e l’artrite indotta dall’antigene (AIA)6. Pertanto, si prevede che questo metodo possa essere utilizzato per indurre costantemente la malattia in altri modelli animali che dipendono da emulsioni acqua-in-olio con autoantigeni, come la neurite autoimmune sperimentale (EAN)10, la tiroidite autoimmune sperimentale (EAT)11, l’uveite autoimmune (EAU)12 e la miastenia grave (MG)13. Questo metodo induce anche risposte immunitarie generali come l’ipersensibilità di tipo ritardato (DTH) in modo coerente6, e potrebbe quindi essere utilizzato per la somministrazione di vaccini contro il cancro e la malaria (vedi discussione).
Pertanto, è stato sviluppato un metodo rapido (tempo di preparazione totale ~ 30 min), semplice (tutti i reagenti possono essere preparati in anticipo e conservati) e standardizzato (l’emulsione viene eseguita utilizzando un omogeneizzatore di agitazione) ed è presentato qui. Le emulsioni CFA/antigene preparate utilizzando questo protocollo inducono costantemente la malattia nei modelli animali autoimmuni.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le emulsioni acqua-in-olio, come l’antigene/adiuvante di Freund, sono state utilizzate per più di mezzo secolo per indurre EAE17. Attualmente non esiste un metodo standardizzato per preparare emulsioni di antigene che sia indipendente dall’influenza umana. La miscelazione manuale con siringhe è standard per la maggior parte dei laboratori, tuttavia questo metodo richiede tempo, spesso comporta un’eccessiva perdita di materiale e la qualità varia a seconda dello scienziato che lo prepara.
<p…Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
L’autore desidera ringraziare le unità abitative degli animali dell’Università di Lund, Camilla Björklöv e Agnieszka Czopek, per il loro sostegno, e Richard Williams, Kennedy Institute of Rheumatology, Università di Oxford, Regno Unito, per le critiche costruttive e il supporto linguistico che produce questo manoscritto.
Materials
| 1 mL Injection syringe | B. Braun | 9166017V | |
| 1 mL Injection syringe | Sigma-Aldrich | Z683531 | |
| 7 ml empty tubes with caps | Bertin-Instruments | P000944LYSK0A.0 | 7 mL tube |
| 50 mL sterile centrifuge tube | Fisher Scientific | 10788561 | 50 mL tube |
| Bordetella pertussis toxin | Sigma-Aldrich | P2980 | Store at -20 °C |
| Dispersant, light mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | Store at RT |
| Emulsion kit | Bertin-Instruments | D34200.10 ea | Containing a tube, cap, and plunger |
| Incomplete Freund's Adjuvant | Sigma-Aldrich | F5506 | Store at +4 °C |
| Mycobacterium tuberculosis, H37RA | Fisher Scientific | DF3114-33-8 | Store at +4 °C |
| Mastersizer 2000 | Malvern Panalytical | N/A | Particle size analyzer |
| Minilys-Personal homogenizer | Bertin-Instruments | P000673-MLYS0-A | Shaking homogenizer |
| MOG 35-55 Peptide | Innovagen | N/A | |
| Montanide ISA 51 VG | Seppic | 36362Z | FDA-approved oil adjuvant |
| Pall Acrodisc Syringe Filters 0.2 μm | Fisher Scientific | 17124381 | Sterlie filter |
| PBS, Ca2+/Mg2+ free | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | PBS |
| Phase-Constrast Microscope | Olympus | BX40-B | |
| Steel Beads 3.2 mm | Fisher Scientific | NC0445832 | Autoclave and store at RT |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 648463 | Store at RT |
Riferimenti
- Walton, C., et al. Rising prevalence of multiple sclerosis worldwide: Insights from the Atlas of MS, third edition. Multiple Sclerosis. 26 (14), 1816-1821 (2020).
- van Langelaar, J., Rijvers, L., Smolders, J., van Luijn, M. M. B and T cells driving multiple sclerosis: identity, mechanisms and potential triggers. Frontiers in Immunology. 11, 760 (2020).
- Sambucci, M., Gargano, F., Guerrera, G., Battistini, L., Borsellino, G. One, No One, and One Hundred Thousand: T Regulatory Cells’ Multiple Identities in Neuroimmunity. Frontiers in Immunology. 10, 2947 (2019).
- Mix, E., Meyer-Rienecker, H., Hartung, H. P., Zettl, U. K. Animal models of multiple sclerosis–potentials and limitations. Progress in Neurobiology. 92 (3), 386-404 (2010).
- Terry, R. L., Ifergan, I., Miller, S. D. Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice. Methods in Molecular Biology. 1304, 145-160 (2016).
- Topping, L. M., et al. Standardization of antigen-emulsion preparations for the induction of autoimmune disease models. Frontiers in Immunology. 13, 892251 (2022).
- Flies, D. B., Chen, L. A simple and rapid vortex method for preparing antigen/adjuvant emulsions for immunization. Journal of Immunological Methods. 276 (1-2), 239-242 (2003).
- Määttä, J. A., Erälinna, J. P., Röyttä, M., Salmi, A. A., Hinkkanen, A. E. Physical state of the neuroantigen in adjuvant emulsions determines encephalitogenic status in the BALB/c mouse. Journal of Immunological Methods. 190 (1), 133-141 (1996).
- Moncada, C., Torres, V., Israel, Y. Simple method for the preparation of antigen emulsions for immunization. Journal of Immunological Methods. 162 (1), 133-140 (1993).
- Waksman, B. H., Adams, R. D. Allergic neuritis: an experimental disease of rabbits induced by the injection of peripheral nervous tissue and adjuvants. The Journal of Experimental Medicine. 102 (2), 213-236 (1955).
- Vladutiu, A. O., Rose, N. R. Autoimmune murine thyroiditis relation to histocompatibility (H-2) type. Science. 174 (4014), 1137-1139 (1971).
- Caspi, R. R. Experimental autoimmune uveoretinitis in the rat and mouse. Current Protocols in Immunology. , (2003).
- Tuzun, E., et al. Guidelines for standard preclinical experiments in the mouse model of myasthenia gravis induced by acetylcholine receptor immunization. Experimental Neurology. 270, 11-17 (2015).
- Brinckerhoff, L. H., et al. Terminal modifications inhibit proteolytic degradation of an immunogenic MART-1(27-35) peptide: implications for peptide vaccines. International Journal of Cancer. 83 (3), 326-334 (1999).
- Kool, M., et al. Alum adjuvant boosts adaptive immunity by inducing uric acid and activating inflammatory dendritic cells. The Journal of Experimental Medicine. 205 (4), 869-882 (2008).
- Hasselmann, J. P. C., Karim, H., Khalaj, A. J., Ghosh, S., Tiwari-Woodruff, S. K. Consistent induction of chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in C57BL/6 mice for the longitudinal study of pathology and repair. Journal of Neuroscience Methods. 284, 71-84 (2017).
- Freund, J., Lipton, M. M. Experimental allergic encephalomyelitis after the excision of the injection site of antigen-adjuvant emulsion. The Journal of Immunology. 75 (6), 454-459 (1955).
- Stromnes, I. M., Goverman, J. M. Active induction of experimental allergic encephalomyelitis. Nature Protocols. 1 (4), 1810-1819 (2006).
- Shaw, M. K., Zhao, X. Q., Tse, H. Y. Overcoming unresponsiveness in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) resistant mouse strains by adoptive transfer and antigenic challenge. Journal of Visualized Experiments. (62), e3778 (2012).
- Arevalo-Herrera, M., et al. Randomized clinical trial to assess the protective efficacy of a Plasmodium vivax CS synthetic vaccine. Nature Communications. 13 (1), 1603 (2022).
- Jiang, C., et al. Potential association factors for developing effective peptide-based cancer vaccines. Frontiers in Immunology. 13, 931612 (2022).
- Neninger Vinageras, E., et al. Phase II randomized controlled trial of an epidermal growth factor vaccine in advanced non-small-cell lung cancer. Journal of Clinical Oncology. 26 (9), 1452-1458 (2008).
