Una pipeline per caratterizzare i difetti cardiaci strutturali nel topo fetale
Summary
Questo articolo descrive in dettaglio i metodi diagnostici di cardiopatia congenita murina (CHD) utilizzando l’ecocardiografia fetale, la necroscopia e l’acquisizione di immagini a fluorescenza episcopica (EFIC) utilizzando la microscopia confocale episcopica (ECM) seguita da ricostruzione tridimensionale (3D).
Abstract
Le malattie cardiache congenite (CHD) sono le principali cause di morte infantile negli Stati Uniti. Nel 1980 e prima, la maggior parte dei pazienti con CHD moderata o grave è morta prima dell’età adulta, con la massima mortalità durante la prima settimana di vita. Notevoli progressi nelle tecniche chirurgiche, negli approcci diagnostici e nella gestione medica hanno portato a notevoli miglioramenti nei risultati. Per affrontare le esigenze di ricerca critiche per comprendere i difetti cardiaci congeniti, i modelli murini hanno fornito una piattaforma di ricerca ideale, in quanto hanno un’anatomia cardiaca molto simile agli esseri umani e brevi tassi di gestazione. La combinazione di ingegneria genetica con strumenti di fenotipizzazione ad alto rendimento ha permesso la replicazione e la diagnosi di difetti cardiaci strutturali per chiarire ulteriormente i percorsi molecolari alla base delle malattie coronariche di CHD. L’uso dell’ecocardiografia fetale non invasiva per lo screening dei fenotipi cardiaci nei modelli murini insieme all’alta fedeltà dell’acquisizione di immagini a fluorescenza episcopica (EFIC) utilizzando l’istopatologia della microscopia confocale episcopica (ECM) con ricostruzioni tridimensionali (3D) consente una visione dettagliata dell’anatomia di vari difetti cardiaci congeniti. Questo protocollo delinea un flusso di lavoro completo di questi metodi per ottenere una diagnosi accurata dei difetti cardiaci congeniti murini. L’applicazione di questo protocollo di fenotipizzazione agli organismi modello consentirà una diagnosi accurata di CHD, fornendo informazioni sui meccanismi della CHD. Identificare i meccanismi alla base della CHD offre opportunità per potenziali terapie e interventi.
Introduction
Le cardiopatie congenite (CHD) sono il difetto alla nascita neonatale più comune 1,2, che colpisce circa lo 0,8%-1,7% dei neonati e provoca una significativa mortalità e morbilità neonatale3. Un’eziologia genetica è fortemente indicata con CHDs 4,5. I modelli murini geneticamente modificati sono stati ampiamente utilizzati per comprendere la complessità delle malattie coronariche e i meccanismi che le causano a causa dei topi con cuori a quattro camere e sequenze di DNA dello sviluppo cardiaco comparabili nei feti di topo e umani6. L’identificazione del fenotipo dei mutanti murini è il primo passo fondamentale per caratterizzare la funzione del gene bersaglio. I modelli murini che esprimono effetti di dosaggio genico, in cui una singola mutazione genetica può provocare uno spettro di difetti cardiaci che imitano i CHD umani, sono importanti per comprendere la complessità dei CHD e i meccanismi che li causano.
Questo articolo delinea una pipeline per caratterizzare i fenotipi cardiaci nei modelli murini. I metodi applicati utilizzano l’ecocardiogramma fetale 7, seguito da necroscopia e istopatologia ECM 7,8, che può visualizzare l’anatomia dettagliata dello sviluppo di fenotipi cardiaci murini. Un ecocardiogramma fetale è una modalità non invasiva che consente la visualizzazione diretta di più embrioni con una risoluzione di imaging ragionevole. Inoltre, un ecocardiogramma fetale fornisce una rapida determinazione del numero totale di embrioni in una cucciolata, delle loro fasi di sviluppo e del relativo orientamento e posizione nel corno uterino. Utilizzando un Doppler spettrale / flusso di colore, gli embrioni anomali possono essere identificati in base alla struttura, al disturbo emodinamico, alla restrizione della crescita o allo sviluppo di idrope. Poiché uno studio ecocardiogramma fetale è una tecnica non invasiva, può essere utilizzato per eseguire scansioni su più giorni e per osservare i cambiamenti nell’emodinamica o nella morfologia cardiaca. Ottenere immagini di alta qualità degli ecocardiogrammi fetali richiede pratica e abilità, poiché specifici difetti cardiaci possono essere persi a causa della mancanza di esperienza e conoscenza. Per questo motivo, un’analisi più definitiva della morfologia cardiaca può essere ottenuta attraverso una combinazione di necroscopia e istopatologia ECM. La necroscopia fornisce la visualizzazione diretta della struttura dell’arco, delle relazioni relative dell’aorta e dell’arteria polmonare, della dimensione dei ventricoli e degli atri, della posizione del cuore rispetto al torace e delle strutture broncopolmonari. Tuttavia, le caratteristiche interne come le valvole cardiache e lo spessore della parete possono essere difficili da valutare attraverso la sola necroscopia. Pertanto, l’istopatologia ECM è raccomandata per una diagnosi conclusiva. L’istopatologia ECM è una tecnica di visualizzazione ad alta risoluzione che consente la ricostruzione sia 2D che 3D dello stack di immagini9. Queste immagini sono ottenute attraverso l’imaging fluorescente episcopico seriale di un campione incorporato in paraffina poiché è sezionato sottilmente ad un intervallo costante da un microtomo automatico. A differenza dell’istologia classica, le immagini vengono catturate come una sezione prima di essere tagliate dal blocco in modo tale che tutte le immagini siano catturate all’interno dello stesso sistema di riferimento. Per questo motivo, lo stack di immagini 2D prodotto dall’istopatologia ECM può essere facilmente e in modo affidabile ricostruito in tre dimensioni. Questo viene fatto utilizzando un visualizzatore DICOM, che consente la visualizzazione 3D delle immagini nei tre piani anatomici: coronale, sagittale e trasversale. Da queste ricostruzioni 3D ad alta risoluzione, può essere fatta una diagnosi cardiaca definitiva. L’applicazione di queste tre diverse modalità di visualizzazione, singolarmente o in combinazione, può fornire caratterizzazioni accurate dei difetti cardiaci strutturali negli embrioni di topo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Topi geneticamente modificati sono stati utilizzati per comprendere i meccanismi patologici dei difetti cardiaci congeniti. I protocolli che forniamo in questo studio tentano di semplificare e standardizzare il processo di valutazione dei difetti cardiaci fetali murina. Tuttavia, ci sono passaggi critici da notare durante il protocollo. Gli embrioni di topo crescono in modo significativo durante ogni giorno di gestazione e il momento corretto per raccogliere un topo può essere determinato eseguendo accuratamente un ecoc…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nessuno.
Materials
| 1x phosphate-buffered saline solution (PBS), PH7.4 | Sigma Aldrich | P3813 | |
| 1.5 mL Eppendorf tubes (or preferred vial for tissue storage) | SealRite | 1615-5599 | |
| 10% buffered formalin phosphate solution | Fisher Chemical | SF100-4 | |
| 100% Ethanol | Decon Laboratories | 2701 | |
| 16% paraformaldehyde (PFA) fixative | ThermoScientific | 28908 | 4% working concentration freshly prepared in 1x PBS at 4 °C |
| 50 mL tubes | Falcon | 352070 | |
| 6–12 Well plate or 20 mL vial for embryo storage | Falcon | 353046 | |
| Dissecting microscope | Leica | MDG36 | |
| Dissecting Pins (A1 or A2 grade) | F.S.T | 26002-15 | |
| Dissecting Plate | F.S.T | FB0875713 | Petri dish with paraffin base |
| Embedding molds | Sakura | 4133 | |
| Extra narrow scissors (10.5 cm) | F.S.T | 14088-10 | 1–2 pairs |
| Fiji application/Image J | NIH | Fiji.sc | |
| Fine tip (0.05 mm x 0.01 mm) Dissecting Forceps (11 cm) | F.S.T | 11252-00 | 2 Pairs |
| Hot forceps | F.S.T | 11252-00 | For orientation of embryos |
| Industrial Marker for Wax Blocks | Sharpie | 2003898 | Formatted for labratory use |
| Jenoptik ProgRes C14plus Microscope Camera | Jenoptik | 017953-650-26 | |
| Jenoptik ProgRess CapturePro acquisition software | Jenoptik | jenoptik.com | |
| Large glass beaker | Fisher Scientific | S111053 | For melting paraffin |
| Leica M165 FC binocular microscope (16.5:1 zoom optics) | Leica | M165 FC | |
| OsiriX MD Version 12.0 | OsiriX | osirix-viewer.com | |
| Paraplast embedding paraffin wax | Millipore Sigma | 1003230215 | |
| Small glass beaker | Fisher Scientific | S111045 | |
| Small, perforated spoon (14.5 cm) | F.S.T | 10370-17 | |
| Straight Vannas Scissors (4–8 mm) | F.S.T | 15018-10 | A pair |
| Vevo2100 ultrahigh-frequency ultrasound biomicroscope | FUJIFILM VisualSonics Inc. | Vevo2100 | |
| Xylene | Fisher Chemical | UN1307 |
Riferimenti
- Wu, W., He, J., Shao, X. Incidence and mortality trend of congenital heart disease at the global, regional, and national level, 1990-2017. Medicina. 99 (23), e20593 (2020).
- vander Linde, D., et al. Birth prevalence of congenital heart disease worldwide: a systematic review and meta-analysis). Journal of the American College of Cardiology. 58 (21), 2241-2247 (2011).
- Yang, Q., et al. Racial differences in infant mortality attributable to birth defects in the United States. Birth Defects Research. Part A, Clinical and Molecular Teratology. 76 (10), 706-713 (1989).
- Patel, A., et al. Prevalence of noncardiac and genetic abnormalities in neonates undergoing cardiac operations: Analysis of the society of thoracic surgeons congenital heart surgery database. The Annals of Thoracic Surgery. 102 (5), 1607-1614 (2016).
- Pierpont, M. E., et al. Genetic basis for congenital heart disease: Revisited: A scientific statement from the American Heart Association. Circulation. 138 (21), e653-e711 (2018).
- Krishnan, A., et al. A detailed comparison of mouse and human cardiac development. Pediatric Research. 76 (6), 500-507 (2014).
- Liu, X., et al. Interrogating congenital heart defects with noninvasive fetal echocardiography in a mouse forward genetic screen. Circulation. Cardiovascular Imaging. 7 (1), 31-42 (2014).
- Liu, X., Tobita, K., Francis, R. J., Lo, C. W. Imaging techniques for visualizing and phenotyping congenital heart defects in murine models. Birth Defects Research. Part C, Embryo Today: Review. 99 (2), 93-105 (2013).
- Tsuchiya, M., Yamada, S. High-resolution histological 3D-imaging: episcopic fluorescence image capture is widely applied for experimental animals. Congenital Anomalies (Kyoto. 54 (4), 250-251 (2014).
- Yu, Q., Tian Leatherbury, ., Lo, X., W, C. Cardiovascular assessment of fetal mice by in utero echocardiography). Ultrasound in Medicine and Biology. 34, 741-752 (2008).
- Rosenthal, J., et al. Rapid high resolution three-dimensional reconstruction of embryos with episcopic fluorescence image capture. Birth Defects Research. Part C, Embryo Today: Review. 72 (3), 213-223 (2004).
- Weninger, W. J., Mohun, T. Phenotyping transgenic embryos: a rapid 3-D screening method based on episcopic fluorescence image capturing. Nature Genetics. 30 (1), 59-65 (2002).
