Engineering onkogene heterozygote gain-of-function mutasjoner i humane hematopoietiske stamceller og stamceller

Denne protokollen krever bruk av sunne donoravledede CD34+ HSPC-er og krever etisk godkjenning fra de lokale institusjonelle gjennomgangsstyrene (IRB) og signert informert samtykke. CD34+ HSPC-ene som ble brukt i denne protokollen ble isolert fra navlestrengsblodet (UCB) av terminleveranser (>34 ukers svangerskap). Informert samtykke ble innhentet fra mødrene før levering, og etisk godkjenning for innsamling av UCB ble innhentet (IRB-godkjenning: 31-322 ex 18/19) fra Medical University of Graz. En fullstendig liste over materialer som brukes i denne protokollen, finner du i materialtabellen. 1. sgRNA-design og evaluering av skjæreeffektivitet Søk etter plasseringen av ønsket mutasjon og riktig transkripsjon på et online databaseverktøy (f.eks. COSMIC, https://cancer.sanger.ac.uk/cosmic). Velg et sgRNA ved siden av mutasjonen (eksonisk målretting) eller i forrige intron (intronic targeting) ved hjelp av et sgRNA-designverktøy. I denne protokollen brukes det elektroniske verktøyet fra Benchling. Se materialtabellen for en liste over mulige elektroniske verktøy for sgRNA-design. Velg alternativet + (opprett) > DNA-sekvens > Importer DNA-sekvenser > Importer fra databaser. Skriv inn ønsket gen, for eksempel CALR og velg menneske som art > Søk > Velg riktig transkripsjon (f.eks. CALR-201 -ENST00000316448) > Import. Velg interesseområdet der du vil introdusere DS-pausen (f.eks. intron 7). Velg CRISPR-alternativet på høyre side av skjermen, og velg Utform og analyser støttelinjer. Velg enkelt guide, hold guidelengden til 20 bp, og PAM-sekvens for redigering med SpCas9 (NGG). Velg en guide med høy poengsum på målet (høy sjanse for redigering på ønsket sted) og en høy off-target score (lav sjanse for redigering ved uønskede loci). Velg minst tre guider for å teste for å finne det best presterende sgRNA. Bestill sgRNA som et kjemisk modifisert syntetisk sgRNA fra en kommersiell leverandør.MERK: Det anbefales på dette stadiet å bestille en liten mengde syntetiske sgRNA for startskjermbildet. Når et godt utførende sgRNA er identifisert, fortsett med en større rekkefølge av det valgte sgRNA. Tine 2 x 105-5 x 105 CD34+ HSPCs. Overfør cellene til 10 ml forvarmet RPMI1640 supplert med 1% antibiotika (f.eks. Penicillin / streptomycin).MERK: CD34+ HSPC-er med en renhet på >90 % bør brukes for å oppnå de beste og mest reproduserbare resultatene. Sentrifuge ved 350 x g ved romtemperatur (RT) i 10 minutter. Tell cellene med et hemocytometer og suspendere cellene i SFEM II-medium supplert med 0,2% penicillin / streptomycin (P / S), 100 ng / ml trombopoietin (TPO), 100 ng / ml stamcellefaktor (SCF), 100 ng / ml FMS-lignende tyrosinkinase 3 ligand (FLT3L), 100 ng / ml interleukin-6 (IL-6), 35 nM UM171 og 0,75 μM StemRegenin1 (SR1) til en konsentrasjon på 2,5 x 105 celler / ml . Inkuber ved 37 °C/5 % CO2 i 48 timer – 72 timer.MERK: Det komplette mediet vil fra nå av bli referert til som HSPC-oppbevaringsmedium. Samle cellene i et 15 ml rør og telle cellene. Kontroller cellens levedyktighet ved å trypan blå ekskludering.Før du starter, slå på transfeksjonssystemet og velg alternativet for kyvettene. Velg riktig program og nukleofeksjonsløsning for HSPC-er (se tabell over materialer). Mellom 2 x 10 5 og5 x 106 celler kan nukleofekteres i en 100 μL kyvette. Sett av et lite antall celler (f.eks. 1 x 10 5-2 x 105) for å holde i kultur i 48 timer som skal brukes som en WT-kontroll. Forbered RNP-komplekset. I et 1,5 ml rør, tilsett 15 μg Cas9 og 8 μg sgRNA (molforhold 1: 2,5) og inkuber ved 25 ° C i 10 minutter i en varmeblokk. Mens RNP-komplekset inkuberer, sentrifugerer cellene ved 350 x g ved RT i 5 minutter og kaster supernatanten ved hjelp av en pipette. Suspender cellene i 100 μL nukleofeksjonsløsning. Bland cellene med RNP-komplekset og overfør til kyvetten. Trykk forsiktig på kyvetten for å fjerne eventuelle luftbobler som kan ha dannet seg under overføringen. Sett kyvetten inn i holderen til transfeksjonssystemet og elektroporate cellene med DZ-100-programmet. Umiddelbart etter elektroporering, tilsett 400 μL forvarmet HSPC-retensjonsmedium uten P/S. Overfør cellene med en fin overføringspipette til en kulturplate som inneholder forvarmet HSPC-retensjonsmedium uten P/S. Avhengig av cellenummeret, bruk en passende kulturplate (24-, 12- eller 6-brønnsplate) for å nå en tetthet mellom 0,25 x 106 og 1 x 106 celler/ml. Overfør platen til inkubatoren ved 37 °C/5 % CO2. Inkuber de nukleofiserte cellene i 6-8 timer. Etter 6-8 timer, fjern det gamle mediet og erstatt med ferskt forvarmet HSPC-retensjonsmedium supplert med P / S. Suspender cellene i en konsentrasjon mellom 2,5 x 105 og 5 x 105 og overfør til en cellekulturplate (24-, 12- eller 6-brønnplate). Inkuber cellene i 48 timer ved 37 °C/5 % CO2. Høst 2 x 10 5 celler og sentrifuger ved 350 x g ved RT i5 minutter. Før start skal varmeblokkene settes til 65 °C og 98 °C. Kast supernatanten og suspender cellene i 1 ml 1x DPBS i et 1,5 ml rør. Sentrifuge ved 350 x g ved RT i 5 min. Kast supernatanten og suspender cellene i 50 μL DNA-ekstraksjonsløsning. Vortex for 15 s. Rug i 6 minutter ved 65 °C. Virvel i 15 s og inkuber i 2 minutter ved 98 °C. Forsterk regionen til DSB ved PCR ved hjelp av primere som genererer en amplicon på omtrent 400-600 bp med DSB i midten. Bruk 0,5-1 μL ekstrahert DNA for PCR-reaksjonen.MERK: På grunn av sammensetningen av DNA-ekstraksjonsløsningen kan DNA-konsentrasjonene ikke kvantifiseres nøyaktig ved spektrofotometri. Kjør PCR-produktet med en DNA-stige på en 1,5 % agarosegel ved 100 V i 45-60 minutter. Plasser gelen på et blått lys eller UV-transilluminator. Trekk ut DNA-båndet av riktig størrelse fra gelen ved å bruke et kommersielt tilgjengelig sett i henhold til produsentens instruksjoner (se materialtabell). Sekvenser prøvene ved hjelp av Sanger-sekvensering ved hjelp av fremoverprimeren eller omvendt primer fra PCR. For PCR-produkter på 400-600 bp i lengde er det nødvendig med 75 ng DNA for sekvensering med en konsentrasjon på 5 ng / ml i et totalt volum på 15 μL. Analyser redigeringseffektiviteten til sgRNA-ene ved å laste opp sekvenseringsfilene til et program designet for å beregne redigeringseffektiviteten ved å identifisere innsetting og slettinger produsert av sgRNA. Velg det sgRNA-et som gir best resultater, for å fortsette med.MERK: Dedikerte elektroniske verktøy er oppført i materialtabellen. Denne analysen krever .ab1-filene til de transfiserte og WT HSPC-ene, sgRNA-sekvensen og PAM-sekvensen. 2. Homologi-rettet reparasjon (HDR) vektor konstruksjon HDR mal designMERK: To HDR-maler bør utformes: en mal for WT-sekvensen og en mal for den muterte sekvensen.Importer genomsekvensen og kodesekvensen (CDS) av det ønskede genet til en passende programvare for molekylær kloning (dedikerte verktøy finnes oppført i materialtabellen). Fra genomisk sekvensfil designer du venstre homologiarm (HA) ved å velge ideelt 400 bp på 5′-enden av DSB. Lim inn denne sekvensen i en ny fil. Hvis et intron er målrettet med sgRNA, må en spleiseakseptorsekvens (SA) inkluderes. Velg de siste 150 bp av det målrettede intronet og lim det inn etter venstre HA. Hvis eksonet er direkte målrettet, er denne sekvensen ikke nødvendig (figur 3). Fra CDS-filen velger du cDNA av interesse. I tilfelle en eksonisk sekvens er målrettet, må du sørge for at cDNA starter umiddelbart nedstrøms for DSB-stedet og inkluderer alle følgende eksoner av genet av interesse, samt stoppkodonet. Hvis et intron er målrettet, må du sørge for at cDNA starter med det første kodonet av følgende ekson. Codon-optimaliser cDNA og sett den inn etter SA-sekvensen. Bruk dedikerte elektroniske verktøy til dette formålet (Table of Materials). Sett inn et 3′ polyadenyleringssignal (PolyA) etter cDNA av interesse (f.eks. SV40 eller bGH) (tabell 1). Etter PolyA, sett inn en promotorsekvens (f.eks. miltfokusdannende virus [SFFV] eller polyubiquitin C [UBC], tabell 1) for det fluorescerende proteinet. Sett inn sekvensen for det fluorescerende proteinet (dvs. enten GFP, BFP eller mCherry). Sett inn et annet, men annet PolyA-signal.MERK: Innsetting av en annen PolyA-sekvens vil unngå problemer som bakteriell rekombinasjon av plasmidet eller problemer med sekvensjustering på grunn av to identiske sekvenser i malen. Fra den genomiske sekvensfilen designer du riktig HA ved å velge ideelt 400 bp på 3′-enden av DSB. Sett inn denne sekvensen etter den andre PolyA. Lag en kopi av hele malen og modifiser cDNA av interesse slik at den inneholder sekvensen av ønsket mutasjon. Bytt det fluorescerende proteinet med et annet fluorescerende protein. Hvis GFP for eksempel ble brukt for WT-malen, bytter du den ut med BFP eller mCherry med mutantmalen. Konstruer og klon HDR-malene i pAAV-MCS-plasmidet (eller andre passende ryggrader).MERK: Fragmentene som kreves for montering kan produseres enten ved PCR eller bestilles kommersielt og må inneholde overlappende sekvenser med sine nærliggende fragmenter. Hvis mutasjonen av interesse er en punktmutasjon, en liten innsetting eller en liten sletting, kan det muterte cDNA produseres ved PCR ved å utføre en stedsrettet mutagenese på HDR-malen som inneholder WT cDNA. Transformer kompetent Escherichia coli med det monterte produktet ved å bruke varmesjokkmetoden. Før du starter, legg bakteriene til å tine på is i 10 minutter. Tilsett 2 μL av de monterte produktene til 50 μL bakterier. Bland innholdet ved å bla forsiktig. Legg prøvene på is i 30 min. Overfør prøvene til et termoblokksett til 42 °C i 30 s. Overfør prøvene på is i 5 min. Tilsett 450 μL romtemperatur SOC-medium og inkuber prøvene ved 37 °C i 1 time. Spred prøvene på LB-agarplater som inneholder ampicillin. For hver prøve, spred 100 μL av tre forskjellige fortynninger av bakterieoppløsningen (ufortynnet, 1:5 og 1:10) for å oppnå LB-agarplater med enkeltkolonier som kan plukkes. Inkuber platene over natten ved 37 °C. Neste dag velger du tre kolonier per prøve. Overfør koloniene til 15 ml rør med lokk som inneholder 4 ml LB-medium supplert med ampicillin og inkubert over natten i en shaker ved 37 °C. Aliquot 500 μL av bakterieoppløsningen fra hver koloni og oppbevar den i kjøleskapet for senere bruk. Utfør en mini-prep for å trekke ut plasmid-DNA i henhold til produsentens instruksjoner. Send prøvene for Sanger-sekvensering for å bekrefte riktig montering av plasmidene. Bruk nok primere fordelt over hele plasmidet for å sikre uavbrutt sekvensbekreftelse, og dekk ideelt hver region to ganger med forover- og bakoveravlesninger. Tilsett 200 μL av bakterieoppløsningen som inneholder riktig montert plasmid til 200 ml LB-medier supplert med ampicillin og inkuber i en shaker over natten ved 37 °C. Utfør en midi- eller maxi-prep for å trekke ut plasmid-DNA i henhold til produsentens instruksjoner. Oppbevar plasmid-DNA ved -20 °C. Rekombinant AAV6 tilberedningMERK: To separate AAV6-preparater må utføres: en for rAAV6 med WT HDR-malen og en for rAAV6 med den muterte HDR-malen. Denne delen beskriver trinnene som trengs for å forberede bare ett virus.Tine HEK293T-celler, overfør cellene til 10 ml forvarmet DMEM supplert med 10% FBS, 1% P / S og 25 mM HEPES, og sentrifuge ved 350 x g ved RT i 5 minutter. Suspendere cellene i en konsentrasjon på 1 x 105 celler / ml og overføre til en egnet kolbe (f.eks en 175 cm2 kolbe). Overfør kolben til en inkubator ved 37 °C/5 % CO2.MERK: HEK293T-celler bør tines på forhånd for å tillate cellene å fullstendig gjenopprette og for å oppnå et tilstrekkelig antall celler (11 x 107 celler er nødvendige for produksjon av ett virus). Det anbefales å bruke cellene etter minst tre passasjer og å holde cellene under 20 passasjer. HEK293T-celler skal deles tre ganger i uken. Mens du opprettholder cellene, bør disse ikke overstige 70% -80% sammenløp. DMEM som brukes i AAV-preparatet, bør også allerede suppleres med L-glutamin og natriumpyruvat. Samle cellene i et 50 ml rør og sentrifuge ved 350 x g ved RT i 5 minutter. Suspender cellene i 20 ml DMEM supplert med 10% FBS, 1% P / S og 25 mM HEPES og telle med et hemocytometer. Bruk trypanblå for utelukkelse av døde celler. Frø 3 x 106 celler i 20 ml DMEM supplert med 10% FBS, 1% P / S og 25 mM HEPES i en 175 cm2 kolbe. For produksjon av ett virus, lag minst fire 175 cm2 kolber. Inkuber cellene ved 37 °C/5 % CO2 i 3 dager.MERK: Dette trinnet utføres best på en fredag, da det gjør at cellene kan utvide seg i løpet av helgen. Høst og tell HEK293T-cellene. For tilberedning av et av virusene, tilbered ti 150 mm retter som hver inneholder 11 x 106 HEK293T i 20 ml DMEM supplert med 10% FBS, 1% P / S og 25 mM HEPES. Plasser oppvasken i inkubatoren ved 37 °C/5% CO2 i 24 timer. Kast forsiktig det gamle mediet og erstatt med 20 ml antibiotikafri DMEM supplert med 10% FBS, 25 mM HEPES og 1 mM natriumbutyrat. Før du fortsetter, må du kontrollere at sammenløpet av cellene ikke er over 80%. Forbered to 15 ml rør som vil inneholde transfeksjonsblandingene. Til rør 1, tilsett 5 ml redusert serummedium, 60 μg rAAV6 mutert HDR-plasmid og 220 μg pDGM6 (hjelperplasmid). Til rør 2, tilsett 5 ml redusert serummedium og 1120 mikroliter 1 mg/ml polyetyleniminoppløsning (PEI, transfeksjonsreagens). Tilsett innholdet i Tube 2 til Tube 1 og vortex i 30 s. Inkuber i 15 minutter ved RT for å sikre riktig innkapsling av DNA i PEI-micellene.MERK: Ikke oppbevar oppløsningen i mer enn 20 minutter. Tilsett forsiktig dråpevis 1,1 ml av løsningen til hver tallerken og fordel ved å virvle forsiktig. Plasser oppvasken i inkubatoren ved 37 °C/5 % CO2 i 48 timer. Etter 48 timer, tilsett 250 μL 0,5 M EDTA til hver tallerken og legg oppvasken i inkubatoren i 10 minutter. Høst cellene ved å vaske dem av fatet og overfør til et 500 ml sentrifugerør eller flere 50 ml rør. Sentrifuge ved 2 000 x g i 10 minutter ved 4 °C. Kast supernatanten. For å sikre fullstendig fjerning av supernatanten, sentrifuger du igjen ved 2000 x g i 1 min ved 4 °C. Kast eventuell gjenværende supernatant. Enhver gjenværende supernatant kan svekke virusrensingen. Løsne pelleten ved vortexing og trekk ut viruset ved å bruke et AAV-rensesett (se Materialfortegnelse) i henhold til produsentens instruksjoner. Alternativt kan du utføre ekstraksjon ved iodixanol gradient ultracentrifugation30,31. Aliquot det rensede viruset og lagre ved -80 ° C. Titrere AAV funksjonelt eller kvantifisere AAV-titeren med digital dråpe-PCR (ddPCR)32 for å bestemme de optimale transduksjonsforholdene. Gjenta denne prosessen for fremstilling av rAAV6 WT HDR-plasmidet. AAV-titrering med ddPCRFør start skal varmeblokkene settes til 65 °C og 98 °C. Ekstrahering av viralt DNA ved å tilsette 15 μL DNA-ekstraksjonsløsning til 5 μL av viruset. Vortex for 15 s. Rug i 6 minutter ved 65 °C. Vortex for 15 s. Rug i 2 minutter ved 98 °C. Bruk det ekstraherte DNA (som er en 1: 4 fortynning av viralt DNA) for å forberede serielle fortynninger (1: 400, 1: 40,000, 1: 160,000, 1: 640,000) med nukleasefri (nf) H2O for ddPCR.MERK: Fortynningene kan oppbevares ved −20 °C hvis ddPCR ikke vil bli utført umiddelbart. Velg tre av fortynningene for ddPCR. Valget av fortynning som skal brukes, avhenger av konsentrasjonen av viruset. Bruk helst tre forskjellige fortynninger (f.eks. 1:40 000, 1:160 000 og 1:640 000) for å finne den beste fortynningen som er innenfor maskinens deteksjonsgrense. Hold reagensene på is mens du arbeider. Forbered en masterblanding (alle prøvene vil bli målt i duplikater). For hver reaksjon, forbered følgende: 12,5 μL ddPCR Supermix for sonder, ingen dUTP, 1,25 μL PrimeTime Std qPCR Assay, AAV-ITR (se Materialtabell) og 6,25 μL nf-H2O. Bland 5 μL DNA med 20 μL av masterblandingen. Utfør dette for fortynningene 1:40 000, 1:160 000 og 1:640 000. Plasser en sylinderampulle i sylinderampulleholderen. Tilsett 70 μL dråpegenereringsolje til sondene i raden denominert som Olje. Vær forsiktig så du ikke genererer bobler. Legg til 20 μL av prøvevolumet i raden betegnet som Prøve. Vær forsiktig så du ikke genererer bobler. Forsegl patronen med pakningen og legg den i dråpegeneratoren. Generer dråpene ved å trykke på startknappen på maskinen, fjern pakningen og overfør forsiktig, med en flerkanalspipette, 40 μL av de genererte dråpene til en 96-brønnsplate. Arbeid sakte for å unngå ødeleggelse av dråper og luftbobler. Forsegl 96-brønnsplaten med gjennomboringsfolie (den røde stripen vendt opp) ved hjelp av PCR-plateforsegleren. Plasser platen i en termocycler. Sett volumet til 40 μL, lokktemperaturen til 105 °C og rampehastigheten til 2 °C/s. Kjør PCR-programmet som beskrevet i tabell 2. Slå på dråpetelleren 30 min før bruk. Åpne programvaren på skrivebordet. Skriv inn plateoppsettet og velg ABS i eksperimentfanen og ddPCR Supermix i Supermix-fanen . Trykk deretter først på PRIME, etterfulgt av å klikke FLUSH SYSTEM på programvaren for å starte systemet. Sett platen inn i leseren. Start kjøringen, og når du er ferdig, eksporter du dataene som en CSV-fil for senere analyse som et regneark.MERK: Tallene som genereres av programvaren er genomkopier (GC) per μL. Disse må multipliseres med fortynningsfaktorene: GC/μL x 5 (fortynning av DNA i masterblandingen) x initial fortynning (dvs. 40 000 eller 160 000). Figur 3: Skjematisk oversikt over intronisk og eksonisk målretting under CRISPR/Cas9 HDR knock-in. Skjematisk sammenligning mellom introniske og eksoniske målrettingsstrategier for CRISPR/Cas9 HDR knock-in. (A) Under intronisk målretting introduseres et dobbeltstrenget brudd i et intron av DNA. HDR-malen består av en LHA-, cDNA-sekvens og RHA. Den introniske målrettingen krever i tillegg tilstedeværelsen av en skiveakseptor som inneholder 3 ‘spleisestedet, grenpunktet og polypyrimidinkanalen. Dette gir mulighet for korrekt spleising. Den grønne stiplede boksen representerer regionen som tilsvarer SA-sekvensen. Størrelsen på SA er 150 bp. (B) Exonic målretting er avhengig av produksjon av en dobbeltstrenget pause direkte i eksonet. HDR-malen består av en LHA-, cDNA-sekvens og RHA. De oransje stiplede boksene indikerer regionene som tilsvarer LHA og RHA. Den ideelle størrelsen på HAs er 400 bp hver. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Arrangører Navn Lengde Beskrivelse SFFV 492 bp Milt Fokus Forming Virus promotor. Sterk pattedyrpromotor. Konstitutivt uttrykt UBC 400 bp Promotor avledet fra det humane ubiquitin C-genet. Konstitutivt uttrykt. CMV 508 bp Promotor avledet fra cytomegalovirus. Det kan inneholde en enhancer region. Konstitutivt uttrykt. Sterk pattedyrpromotor. Kan bringes til taushet. EF-1a 1182 bp Human eukaryotisk oversettelse forlengelse faktor 1 alfa promotor. Konstitutivt uttrykt. Sterk pattedyrpromotor. EFS 200-300 bp EF-1 alfa intron-mindre kortform CAG 584 bp Hybrid pattedyrpromotor som inneholder CMV early enhancer (C), kylling beta aktin promotor (A), og spleis akseptor for kanin beta-globin genet (G). Konstitutivt uttrykt. Polyadenylering (PolyA) signaler Forkortelse Lengde Beskrivelse SV40 PolyA 82-122 bp Simian virus 40 polyadenylering signal bGH PolyA 224 bp Bovin veksthormon polyadenylering signal rbGlob PolyA 56 bp Kanin beta globin polyadenylering signal Tabell 1: Promotorer og polyadenyleringssignaler. Skritt Temperatur Tid Sykluser Enzymaktivering 95 °C 10 minutter 1x Denaturering 94 °C 30 sekunder 42x Annealing 60 °C 1 minutt Forlengelse 72 °C 30 sekunder Deaktivering av enzymer 98 °C 10 minutter 1x Holde 4 °C ∞ Tabell 2: Digitalt dråpe-PCR-program. 3. Redigering av HSPC-er Transfeksjon og transduksjon av HSPCerTine CD34+ HSPC-er og overføre cellene til 10 ml forvarmet RPMI supplert med 1 % P/S. Sentrifuge ved 350 x g ved RT i 10 minutter. Suspender cellene i HSPC-retensjonsmedium til en konsentrasjon på 2,5 x 10 5 celler/ml og inkuber ved 37 °C/5 % CO2 i 48 timer – 72 timer. Høst cellene i et 15 ml rør. Tell cellene og sjekk cellens levedyktighet ved trypan blå eksklusjon. Mellom 2 x 10 5 og5 x 106 celler kan nukleofekteres i en enkelt kyvette. Klargjør riktig antall kyvetter avhengig av beregnet cellenummer. Forbered RNP-komplekset. I et 1,5 ml rør, tilsett 15 μg Cas9 og 8 μg sgRNA (molforhold 1: 2,5) og inkuber ved 25 ° C i 10 minutter i en varmeblokk. Mens RNP-komplekset inkuberer, sentrifugerer cellene ved 350 x g i 5 minutter og kaster bort supernatanten. Suspender cellene i 100 μL nukleofeksjonsløsning. Bland cellene med RNP-komplekset og overfør til kyvetten. Bank forsiktig på kyvetten for å fjerne eventuelle gjenværende luftbobler som kan ha dannet seg under overføringen. Sett kyvetten inn i holderen til transfeksjonssystemet og elektroporate cellene som tidligere beskrevet i sgRNA-designseksjonen. Umiddelbart etter elektroporering, tilsett 400 μL forvarmet HSPC-retensjonsmedium uten P/S og overfør cellene med en fin overføringspipette til en vevskulturplate som inneholder 500 μL forvarmet HSPC-retensjonsmedium uten P/S. Avhengig av cellenummeret, bruk en passende kulturplate (24-, 12- eller 6-brønnsplate) for å nå en tetthet mellom 0,25 x 106 og 1 x 106 celler / ml. Overfør platen til inkubatoren ved 37 °C/5 % CO2. Tine hetteglassene med de frosne rAAV-ene på is. Transduser cellene ved å pipettere den optimale mengden av hver rAAV6 til cellesuspensjonen. Utfør transduksjonen innen 20-30 minutter etter elektroporeringen for å få høy transduksjonseffektivitet.MERK: Den optimale konsentrasjonen av hvert virus (ett virus for WT HDR-malen og et annet separat virus for den muterte HDR-malen) bør bestemmes eksperimentelt. Vanligvis resulterer 5,000-10,000 GC / celle (f.eks. 5 x 109 GC for 1 x 106 celler) i høy transduksjon. Bland cellesuspensjonen forsiktig med pipetten. Inkuber de transduserte cellene i 6-8 timer ved 37 °C/5 % CO2. Etter 6-8 timer, samle cellene i et rør og sentrifuge ved 350 x g ved RT i 5 minutter. Kast det gamle mediet og erstatt med ferskt forvarmet HSPC-oppbevaringsmedium supplert med P/S. Suspender cellene i en konsentrasjon mellom 2,5 x 105-5 x 105 celler / ml og overfør til en vevsbehandlet cellekulturplate (24-, 12- eller 6-brønnplate). Inkuber cellene i 48 timer ved 37 °C/5 % CO2 før du fortsetter med sorteringen. Strømningssortering av de konstruerte HSPC-ene med den heterozygote GOF-mutasjonenHøst cellene i et 15 ml rør og sentrifuge ved 350 x g ved RT i 5 minutter. Fjern supernatanten, suspender cellene i 1 ml DPBS som inneholder 0,1% BSA, og sentrifuger igjen ved 350 x g ved RT i 5 minutter. Kast supernatanten og suspender cellene i et passende volum DPBS + 0,1% BSA, avhengig av cellenummeret.MERK: Det anbefales å suspendere cellene med et minimumsvolum på 200 μL og ikke overstige 1 x 107 celler / ml for å redusere risikoen for tilstopping av sorteringsmaskinen. Overfør cellene til et sterilt FACS-rør utstyrt med en hette. Tilsett 7-AAD eller annet levedyktighetsfargestoff (avhengig av deres kompatibilitet med fluorescerende proteiner) til cellesuspensjonen for levende / døde celleekskludering. Sorter levende celler som er dobbelt positive for fluorescerende reporterproteiner i et samlingsrør som inneholder 200 μL HSPC-retensjonsmedium.MERK: Passende kontroller som består av celler som bare er transdusert med AAV-er, bør legges til for å sikre riktig gating under sorteringsprosedyren. Sentrifuger de sorterte cellene ved 350 x g ved RT i 5 minutter og suspenderer cellene i HSPC-retensjonsmedium ved en konsentrasjon på 2,5 x 105 celler / ml for videre ekspansjon i kultur eller bruk cellene direkte til funksjonelle analyser. 4. Bekreftelse på vellykket genredigering Genomisk DNA-ekstraksjonFør start skal varmeblokkene settes til 65 °C og 98 °C. Høst 2 x 10 5 genomredigerte og sorterte celler og sentrifuge ved 350 x g i5 minutter. Trekk ut gDNA som tidligere beskrevet. Bruk enten DNA-oppløsningen direkte til PCR eller oppbevar ved −20 °C. Inn-ut PCRDesign to primere for å forsterke 5’ innsettingsstedet (figur 4A): primer forward 1 retter seg mot det genomiske lokuset utenfor venstre homologiarm; primer omvendt 2 retter seg mot den integrerte sekvensen. For in-out PCR, lag følgende PCR-blanding per reaksjon:10 μL PCR Master Mix (2x; se materialtabell)1 μL primer fremover 1 (10 μM lager)1 μL primer revers 2 (10 μM lager)0,5-1,0 μL ekstrahert DNANukleasefri H2O til et endelig volum på 20 μLMERK: For mer enn én reaksjon anbefales det å lage en masterblanding som inneholder en ekstra reaksjon for å ta hensyn til pipetteringsfeil. Det er viktig å inkludere en ikke-malkontroll og mal-DNA fra en mock-behandlet prøve. Kjør PCR-reaksjonene med riktig termisk sykkelprogram (se produsentens instruksjoner).MERK: Det anbefales å først teste ut primerparet for optimal glødetemperatur. Dette kan gjøres ved å beregne Tm og deretter ved å kjøre PCR med en termocykler som kan utføre en gradienttemperatur. Kjør PCR-produktene med en DNA-stige på en 1,5% agarosegel ved 100 V i 45-60 minutter (figur 4B). Plasser gelen på et blått lys eller UV-transilluminator. Excise båndene fra gelen. Trekk ut DNA fra båndene ved hjelp av et DNA-gelekstraksjonssett. Send de ekstraherte PCR-prøvene med passende primere for Sanger-sekvensering for å bekrefte riktig og sømløs integrasjon av ønsket cDNA ved det endogene genlokuset. Figur 4: Validering av genomisk integrasjon ved inn-ut PCR. (A) Skjematisk fremstilling av PCR-strategien inn-ut. I den avbildede strategien ble to primere designet. Primeren fremover 1 retter seg mot det genomiske lokuset utenfor LHA, og primeren omvendt 2 retter seg mot den kodonoptimaliserte sekvensen. (B) Skjematisk fremstilling av en agarosegelelektroforese. Bare vellykkede redigerte celler (RNP + AAV) vil generere et PCR-produkt under PCR-utgangen, mens de uredigerte prøvene (kun AAV) ikke vil generere et PCR-produkt. Forkortelse: NTC = ikke-malkontroll. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.