In vivo Estudo em Tempo Real dos Efeitos de Drogas no Fluxo Sanguíneo Carotídeo no Feto Ovino
Summary
O presente protocolo descreve um método para administrar drogas e agentes modificadores da expressão gênica perivascularmente em um feto em desenvolvimento intra-utero . É importante ressaltar que o efeito de drogas/agentes sobre o fluxo sanguíneo pode ser medido com a progressão da gravidez.
Abstract
A capacidade de um organismo de manter um fluxo sanguíneo constante para o cérebro em resposta a picos súbitos de pressão arterial sistêmica (PA) é conhecida como autoregulação cerebral (RCA), que ocorre na artéria carótida. Ao contrário dos recém-nascidos a termo, os prematuros são incapazes de reduzir o fluxo sanguíneo cerebral (FSC) em resposta ao aumento da PA sistêmica. Em neonatos prematuros, isso expõe os frágeis vasos cerebrais a altas pressões de perfusão, levando à sua ruptura e dano cerebral. Estudos ex vivo usando miografia com fio demonstraram que as artérias carótidas de fetos próximos ao termo se contraem em resposta à ativação de receptores alfa1 adrenérgicos. Essa resposta é atenuada no feto prematuro. Assim, para examinar o papel da alfa1-RA in vivo, apresenta-se aqui uma abordagem inovadora para determinar os efeitos de drogas em um segmento arterial carotídeo in vivo em um feto ovino durante a progressão do desenvolvimento da gestação. Os dados apresentados demonstram a mensuração simultânea do fluxo sanguíneo fetal e da pressão arterial. O sistema de liberação perivascular pode ser usado para realizar um estudo de longo prazo durante vários dias. Aplicações adicionais para este método poderiam incluir sistemas de liberação viral para alterar a expressão de genes em um segmento da artéria carótida. Estes métodos podem ser aplicados a outros vasos sanguíneos no organismo em crescimento no útero , bem como em organismos adultos.
Introduction
O nascimento causa estresse ao feto, e há um aumento considerável nos níveis de catecolaminas, o principal hormônio do estresse 1,2. Isso eleva a PA sistêmica e, se essa pressão for transmitida aos frágeis capilares cerebrais através das artérias carótidas, pode levar à sua ruptura 3,4,5. Surtos na PA sistêmica são impedidos de atingir o cérebro pela constrição das artérias carótidas no feto a termo. Entretanto, esse mecanismo não está desenvolvido no feto prematuro, sendo responsável pela probabilidade significativamente maior de lesão cerebral em fetos prematuros 4,5.
Atualmente, não existe um método adequado para examinar a maturação das vias envolvidas na regulação do fluxo sanguíneo carotídeo em fetos em desenvolvimento. Esses estudos sobre fluxo sanguíneo carotídeo e vasorresponsividade são cruciais tanto do ponto de vista científico quanto clínico. Atualmente, para determinar as vias moleculares envolvidas na regulação da contratilidade arterial, o método padrão envolve o isolamento dos segmentos arteriais post-mortem. Em seguida, os experimentos são conduzidos por meio de miografia com fio para determinar a vasocontratilidade de diferentes moléculas farmacológicas que definem as vias regulatórias envolvidas na contratilidade arterial 6,7. É importante notar que os achados ex vivo não são capazes de replicar totalmente o ambiente in vivo devido à regulação do fluxo sanguíneo a montante e a jusante da artéria carótida. Assim, o presente estudo teve como objetivo desenvolver uma técnica que possa determinar os efeitos de substâncias químicas ou agentes vasorresponsivos sobre o fluxo sanguíneo em uma artéria in vivo.
A metodologia de liberação perivascular descrita neste artigo fornece uma abordagem in vivo para estudar o efeito da manipulação farmacológica ou genética de vias de sinalização em diferentes segmentos arteriais. Usando este método, pode-se manipular a pressão arterial fetal e o fluxo sanguíneo carotídeo. Adicionalmente, experimentos com fetos ovinos são demonstrados para estudar os efeitos de moléculas sinalizadoras em um feto em desenvolvimento. Espera-se que a metodologia detalhada fornecida leve a novas investigações no campo dos estudos do fluxo sanguíneo, especialmente em relação à fisiologia e patologia fetal.
Protocol
Representative Results
Discussion
Atualmente, não existe um método para examinar a contratilidade e dilatação vascular in vivo em resposta a compostos de drogas e manipulação gênica. Como padrão no campo, o fluxo sanguíneo in vivo é medido por sondas de fluxo Doppler, microesferas e moléculas radioativas, como água tritiada. No entanto, para manipular as funções dos receptores ou a sinalização a jusante, os animais são sacrificados, e experimentos são realizados in vitro em banhos de órgãos após o isolament…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Fundos intramuros da Universidade do Arizona foram usados para esses estudos.
Materials
| Aaron Bovie Electrosurgical Cautery | Henry Schein, Inc | 5905974 | |
| Aaron Bovie Electrosurgical Generator | Henry Schein, Inc | 1229913 | |
| Alfalfa Pellets | Sacate Pellet Mills, Inc. Maricopa AZ | 100-80 | |
| Analog to Digital Converter | ADI Instruments | Powerlab | |
| Babcock forceps | Roboz Surgicals | RS8020 | |
| Bridge Amplifier | ADI Instruments | Bridge Amplifier | |
| Castroviejo scissors | Roboz Surgicals | RS5650SC | |
| Diazepam | Henry Schein, Inc | 1278188 | |
| Endotracheal Tube | Henry Schein, Inc | 7020408 | |
| Flow Probes | Transonic Systems Inc. | MC2PSS-JS-WC100-CRS10-GC, MC3PSS-LS-WC100-CRS10-GC | |
| Heparin | Henry Schein, Inc | 1162406 | |
| Isoflurane | Henry Schein, Inc | 1182097 | |
| Ketamine | Henry Schein, Inc | 1273383 | |
| Ketoprofen | Zoetis Inc., Kalamazoo, MI | Ketofen | |
| Manifold Pump Tubing | Fisher Scientific | 14-190-508 | |
| Metzenbaum scissors | Roboz Surgicals | RS6010 | |
| Narkomed 4 Anesthesia Machine | North American Dräger | Narkomed 4 | |
| Normal Saline | Fisher Scientific | Z1376 | |
| penicillin G procaine suspension | Henry Schein, Inc | 7455874 | |
| phenylbutazone | VetOne Boise, ID | 510226 | |
| Phenylephrine | Sigma Aldrich Inc. | P1240000 | |
| Pivodine Scrub | VetOne | 510094 | Germicidal cleanser |
| PowerLab | ADInstruments | Data acquisition hardware device | |
| Pulse Oximeter | Amazon Inc. | UT100V | |
| Tygon Tubing | Fisher Scientific | ND-100-80 | |
| V-Top Surgical Table | VetLine Veterinary Classic Surgery | TSP-4010 | |
| Wound Clips | Fisher Scientific | 10-001-024 |
Riferimenti
- Lagercrantz, H., Slotkin, T. A. The "stress" of being born. Scientific American. 254 (4), 100-107 (1986).
- Ronca, A. E., Abel, R. A., Ronan, P. J., Renner, K. J., Alberts, J. R. Effects of labor contractions on catecholamine release and breathing frequency in newborn rats. Behavioral Neuroscience. 120 (6), 1308-1314 (2006).
- Czynski, A., et al. Cerebral autoregulation is minimally influenced by the superior cervical ganglion in two- week-old lambs, and absent in preterm lambs immediately following delivery. PLoS One. 8 (12), e82326 (2013).
- Ballabh, P. Pathogenesis and prevention of intraventricular hemorrhage. Clinics in Perinatology. 41 (1), 47-67 (2014).
- Ballabh, P. Intraventricular hemorrhage in premature infants: Mechanism of disease. Pediatric Research. 67 (1), 1-8 (2010).
- Goyal, R., Goyal, D., Chu, N., Van Wickle, J., Longo, L. Cerebral artery alpha-1 AR subtypes: High altitude long-term acclimatization responses. PLoS One. 9 (11), e112784 (2014).
- Goyal, R., Mittal, A., Chu, N., Zhang, L., Longo, L. D. alpha(1)-Adrenergic receptor subtype function in fetal and adult cerebral arteries. American Journal of Physiology – Heart and Circulatory Physiology. 298 (1), H1797-H1806 (2010).
- Goyal, D., Goyal, R. Developmental maturation and alpha-1 adrenergic receptors-mediated gene expression changes in ovine middle cerebral arteries. Scientific Reports. 8 (1), 1772 (2018).
- Goyal, R., et al. Maturation and the role of PKC-mediated contractility in ovine cerebral arteries. American Journal of Physiology – Heart and Circulatory Physiology. 297 (6), H2242-H2252 (2009).
- Gratton, R., Carmichael, L., Homan, J., Richardson, B. Carotid arterial blood flow in the ovine fetus as a continuous measure of cerebral blood flow. Journal of the Society for Gynecologic Investigation. 3 (2), 60-65 (1996).
- Bishai, J. M., Blood, A. B., Hunter, C. J., Longo, L. D., Power, G. G. Fetal lamb cerebral blood flow (CBF) and oxygen tensions during hypoxia: a comparison of laser Doppler and microsphere measurements of CBF. Journal of Physiology. 546, 869-878 (2003).
- Ashwal, S., Dale, P. S., Longo, L. D. Regional cerebral blood flow: studies in the fetal lamb during hypoxia, hypercapnia, acidosis, and hypotension). Pediatric Research. 18 (12), 1309-1316 (1984).
