In vivo Étude en temps réel des effets des médicaments sur le flux sanguin carotidien chez le fœtus ovin
Summary
Le présent protocole décrit une méthode d’administration périvasculaire de médicaments et d’agents modifiant l’expression génique chez un fœtus en développement in utero . Il est important de noter que l’effet des médicaments/agents sur le flux sanguin peut être mesuré avec la progression de la grossesse.
Abstract
La capacité d’un organisme à maintenir un flux sanguin constant vers le cerveau en réponse à des augmentations soudaines de la pression artérielle systémique (PA) est connue sous le nom d’autorégulation cérébrale (CAR), qui se produit dans l’artère carotide. Contrairement aux nouveau-nés nés à terme, les nouveau-nés prématurés sont incapables de réduire le débit sanguin cérébral (CBF) en réponse à une augmentation de la pression artérielle systémique. Chez les nouveau-nés prématurés, cela expose les vaisseaux cérébraux fragiles à des pressions de perfusion élevées, entraînant leur rupture et des lésions cérébrales. Des études ex vivo utilisant la myographie filaire ont démontré que les artères carotides des fœtus à court terme se contractent en réponse à l’activation des récepteurs alpha1 adrénergiques. Cette réponse est émoussée chez le fœtus prématuré. Ainsi, pour examiner le rôle de l’alpha1-AR in vivo, voici une approche innovante pour déterminer les effets des médicaments sur un segment artériel carotidien in vivo chez un fœtus ovin au cours de la progression développementale de la gestation. Les données présentées démontrent la mesure simultanée du débit sanguin fœtal et de la pression artérielle. Le système d’administration périvasculaire peut être utilisé pour mener une étude à long terme sur plusieurs jours. D’autres applications de cette méthode pourraient inclure des systèmes d’administration virale pour modifier l’expression des gènes dans un segment de l’artère carotide. Ces méthodes pourraient être appliquées à d’autres vaisseaux sanguins de l’organisme en croissance in utero ainsi qu’aux organismes adultes.
Introduction
La naissance provoque du stress pour le fœtus et il y a une augmentation considérable des niveaux de catécholamines, la principale hormone du stress 1,2. Cela augmente la pression artérielle systémique, et si cette pression est transmise aux capillaires cérébraux fragiles via les artères carotides, cela peut entraîner leur rupture 3,4,5. Les poussées de pression artérielle systémique sont empêchées d’atteindre le cerveau par la constriction des artères carotides chez le fœtus à terme. Cependant, ce mécanisme n’est pas développé chez le fœtus prématuré, ce qui est responsable de la probabilité significativement plus élevée de lésions cérébrales chez les fœtus prématurés 4,5.
Actuellement, il n’existe aucune méthode appropriée pour examiner la maturation des voies impliquées dans la régulation du flux sanguin carotidien chez les fœtus en développement. Ces études sur le débit sanguin carotidien et la vasoréactivité sont cruciales à la fois d’un point de vue scientifique et clinique. Actuellement, pour déterminer les voies moléculaires impliquées dans la régulation de la contractilité artérielle, la méthode standard consiste à isoler les segments artériels post-mortem. Ensuite, les expériences sont menées à l’aide de la myographie filaire pour déterminer la vasocontractilité de différentes molécules pharmacologiques qui définissent les voies régulatrices impliquées dans la contractilité artérielle 6,7. Il convient de noter que les résultats ex vivo ne sont pas en mesure de reproduire complètement l’environnement in vivo en raison de la régulation du flux sanguin en amont et en aval de l’artère carotide. Ainsi, la présente étude visait à développer une technique permettant de déterminer les effets de produits chimiques ou d’agents vasosensibles sur le flux sanguin dans une artère in vivo.
La méthodologie d’administration périvasculaire décrite dans cet article fournit une approche in vivo pour étudier l’effet de la manipulation pharmacologique ou génétique des voies de signalisation sur différents segments artériels. En utilisant cette méthode, on peut manipuler la pression artérielle fœtale et le flux sanguin carotidien. De plus, des expériences sur des fœtus de mouton sont démontrées pour étudier les effets des molécules de signalisation chez un fœtus en développement. Espérons que la méthodologie détaillée fournie conduira à de nouvelles recherches dans le domaine des études sur le flux sanguin, en particulier en ce qui concerne la physiologie et la pathologie fœtales.
Protocol
Representative Results
Discussion
À l’heure actuelle, il n’existe aucune méthode pour examiner la contractilité et la dilatation des vaisseaux in vivo en réponse à des composés médicamenteux et à la manipulation de gènes. En tant que norme dans le domaine, le débit sanguin in vivo est mesuré par des sondes de flux Doppler, des microsphères et des molécules radioactives telles que l’eau tritiée. Cependant, pour manipuler les fonctions des récepteurs ou la signalisation en aval, les animaux sont sacrifiés, et des exp…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Des fonds intra-muros de l’Université de l’Arizona ont été utilisés pour ces études.
Materials
| Aaron Bovie Electrosurgical Cautery | Henry Schein, Inc | 5905974 | |
| Aaron Bovie Electrosurgical Generator | Henry Schein, Inc | 1229913 | |
| Alfalfa Pellets | Sacate Pellet Mills, Inc. Maricopa AZ | 100-80 | |
| Analog to Digital Converter | ADI Instruments | Powerlab | |
| Babcock forceps | Roboz Surgicals | RS8020 | |
| Bridge Amplifier | ADI Instruments | Bridge Amplifier | |
| Castroviejo scissors | Roboz Surgicals | RS5650SC | |
| Diazepam | Henry Schein, Inc | 1278188 | |
| Endotracheal Tube | Henry Schein, Inc | 7020408 | |
| Flow Probes | Transonic Systems Inc. | MC2PSS-JS-WC100-CRS10-GC, MC3PSS-LS-WC100-CRS10-GC | |
| Heparin | Henry Schein, Inc | 1162406 | |
| Isoflurane | Henry Schein, Inc | 1182097 | |
| Ketamine | Henry Schein, Inc | 1273383 | |
| Ketoprofen | Zoetis Inc., Kalamazoo, MI | Ketofen | |
| Manifold Pump Tubing | Fisher Scientific | 14-190-508 | |
| Metzenbaum scissors | Roboz Surgicals | RS6010 | |
| Narkomed 4 Anesthesia Machine | North American Dräger | Narkomed 4 | |
| Normal Saline | Fisher Scientific | Z1376 | |
| penicillin G procaine suspension | Henry Schein, Inc | 7455874 | |
| phenylbutazone | VetOne Boise, ID | 510226 | |
| Phenylephrine | Sigma Aldrich Inc. | P1240000 | |
| Pivodine Scrub | VetOne | 510094 | Germicidal cleanser |
| PowerLab | ADInstruments | Data acquisition hardware device | |
| Pulse Oximeter | Amazon Inc. | UT100V | |
| Tygon Tubing | Fisher Scientific | ND-100-80 | |
| V-Top Surgical Table | VetLine Veterinary Classic Surgery | TSP-4010 | |
| Wound Clips | Fisher Scientific | 10-001-024 |
Riferimenti
- Lagercrantz, H., Slotkin, T. A. The "stress" of being born. Scientific American. 254 (4), 100-107 (1986).
- Ronca, A. E., Abel, R. A., Ronan, P. J., Renner, K. J., Alberts, J. R. Effects of labor contractions on catecholamine release and breathing frequency in newborn rats. Behavioral Neuroscience. 120 (6), 1308-1314 (2006).
- Czynski, A., et al. Cerebral autoregulation is minimally influenced by the superior cervical ganglion in two- week-old lambs, and absent in preterm lambs immediately following delivery. PLoS One. 8 (12), e82326 (2013).
- Ballabh, P. Pathogenesis and prevention of intraventricular hemorrhage. Clinics in Perinatology. 41 (1), 47-67 (2014).
- Ballabh, P. Intraventricular hemorrhage in premature infants: Mechanism of disease. Pediatric Research. 67 (1), 1-8 (2010).
- Goyal, R., Goyal, D., Chu, N., Van Wickle, J., Longo, L. Cerebral artery alpha-1 AR subtypes: High altitude long-term acclimatization responses. PLoS One. 9 (11), e112784 (2014).
- Goyal, R., Mittal, A., Chu, N., Zhang, L., Longo, L. D. alpha(1)-Adrenergic receptor subtype function in fetal and adult cerebral arteries. American Journal of Physiology – Heart and Circulatory Physiology. 298 (1), H1797-H1806 (2010).
- Goyal, D., Goyal, R. Developmental maturation and alpha-1 adrenergic receptors-mediated gene expression changes in ovine middle cerebral arteries. Scientific Reports. 8 (1), 1772 (2018).
- Goyal, R., et al. Maturation and the role of PKC-mediated contractility in ovine cerebral arteries. American Journal of Physiology – Heart and Circulatory Physiology. 297 (6), H2242-H2252 (2009).
- Gratton, R., Carmichael, L., Homan, J., Richardson, B. Carotid arterial blood flow in the ovine fetus as a continuous measure of cerebral blood flow. Journal of the Society for Gynecologic Investigation. 3 (2), 60-65 (1996).
- Bishai, J. M., Blood, A. B., Hunter, C. J., Longo, L. D., Power, G. G. Fetal lamb cerebral blood flow (CBF) and oxygen tensions during hypoxia: a comparison of laser Doppler and microsphere measurements of CBF. Journal of Physiology. 546, 869-878 (2003).
- Ashwal, S., Dale, P. S., Longo, L. D. Regional cerebral blood flow: studies in the fetal lamb during hypoxia, hypercapnia, acidosis, and hypotension). Pediatric Research. 18 (12), 1309-1316 (1984).
