Escherichia coli'de Antibiyotik Kalıcılığının Popülasyon ve Tek Hücre Analizi

NOT: Steril kültür cam eşyaları, pipet uçları ve büyüme ortamı kullanın. Burada, E. coli hücreleri kimyasal olarak tanımlanmış düşük otofloresanslı bir ortamda yetiştirilmiştir (bakınız Malzeme Tablosu). Kontaminasyon riskini en aza indirmek için aşılamalar bir Bunsen brülörü varlığında gerçekleştirildi. 1. Hücre kültürü ve büyüme eğrisi Bir Luria-Bertaini (LB) agar plakası (gerekirse seçici bir antibiyotik ile desteklenmiş) üzerinde dondurulmuş bir gliserol stoğundan gelen ilgi suşunu çizin ve tek koloniler elde etmek için gece boyunca 37 ° C’de (15 saat ile 19 saat arasında) inkübe edin.NOT: Burada sunulan deney, wt suşuna karşılık gelen E. coli K-12 MG1655 ve izojenik MG1655 hupA-mCherry suşu22 olmak üzere iki suş kullanmaktadır. İkinci suş, HU nükleoid ile ilişkili proteinin floresan etiketli α alt birimini ifade eder. HupA-mCherry muhabiri, hupA’nın doğal lokusuna entegre edilmiştir. HU-mCherry, DNA’ya spesifik olmayan bir şekilde bağlandığı için canlı hücrelerdeki nükleoid dinamiklerini takip etmek için bir vekil görevi görür. 5 mL ortamı aşılayın (burada, 3-[N-morfolino] propansülfonik asit bazlı ortam [MOPS]; Tablo 1, Tablo 2 ve Tablo 3)% 0.4 glikoz ve bir cam tüp (≥25 mL) içinde izole bir koloni ile seçici bir antibiyotik (gerekirse) ile desteklenmiş ve tüpü gece boyunca (15 saat ile 19 saat arasında) 37 ° C ve dakikada 180 rotasyon (rpm) olarak ayarlanmış bir sallama inkübatörüne yerleştirin. Alternatif olarak, cam tüpler yerine plastik tüpler, cam veya plastik şişeler (≥ 25 mL) kullanılabilir.NOT: Bu yazıda açıklanan deneyler boyunca,% 0.4’lük bir nihai konsantrasyonda gliserol ile takviye edilen MOPS ortamı, MOPS glikozunda% 0.4’lük bir gece kültürleri hariç, kullanılmıştır. Glikoz ile desteklenen MOPS’ta E. coli’nin üretim süresi, MOPS gliseroldekinden daha kısadır. Bu adımda MOPS gliserol %0.4 yerine %0.4 MOPS glukoz kullanılması, hücrelerin 19 saat içinde durağan faza ulaşmasını sağlar. M9 veya farklı karbon kaynaklarıyla desteklenmiş zengin tanımlı ortam (RDM) gibi diğer büyüme ortamları da kullanılabilir. Bununla birlikte, büyüme hızının ve kalıcılık sıklığının, kullanılan ortama ve / veya karbona bağlı olarak farklı olduğu belirtilmelidir23. Ertesi sabah, 1 mL kültürü 3 dakika boyunca 2.300 x g’de santrifüj edin, süpernatanı atın ve peleti aynı hacimde fosfat tamponlu salin (PBS) içinde yavaşça askıya alın. Optik yoğunluğu 600 nm’de (OD600 nm) ölçün ve 2 mL’lik son hacimde 0,01’lik ilk OD600 nm için gereken hacmi hesaplayın. 2 mL MOPS gliserol% 0.4 ortamını berrak bir taban 24 delikli plakanın bir kuyucuğuna yerleştirin ve hesaplanan gece kültür hacmi ile aşılayın. OD600 nm’yi 24 saat boyunca izlemek için 24 delikli plakayı otomatik bir mikroplaka okuyucuya yerleştirin (bkz. Mikroplaka okuyucuyu, OD600 nm’yi her 15 dakikada bir 37 °C sıcaklıkta ve yüksek yörüngesel dönüşle (140 rpm) ölçecek şekilde ayarlayın.NOT: Deneyde kullanılan suş bir floresan muhabiri kodluyorsa, büyüme hızı antibiyotik kalıcılık sıklığını etkilediğinden, sonraki deneylerde herhangi bir artefakttan kaçınmak için büyüme hızının wt’ninkiyle karşılaştırılabilir olduğundan emin olun23. Çok düşük hücre yoğunluklarındaki algılama sınırlamaları ve OD600 nm/koloni oluşturan birimler (CFU) ilişkisi üzerindeki potansiyel suşa özgü etkiler nedeniyle, karakterize edilmemiş suşlarla çalışırken CFU·mL-1’i izleyerek büyüme kinetiğinin değerlendirilmesi önerilir. 2. Antibiyotiklerin minimal inhibitör konsantrasyonunun belirlenmesi NOT: Minimum inhibitör konsantrasyonu (MIC), bakteri üremesinin gözlenmediği en düşük antibiyotik dozu olarak tanımlanır. MIC’nin belirlenmesi her antibiyotik ve suş için yapılmalıdır. Burada açıklanan deneylerde, florokinolon antibiyotik ofloksasin (OFX) kullanılmıştır. MIC’nin belirlenmesi, antibiyotik çözeltisinin doğru hazırlandığının, antibiyotiğin aktif olduğunun ve suşların antibiyotiğe eşit derecede duyarlı olduğunun doğrulanmasını sağlar. Burada,24 kullanılan farklı suşların MIC’den OFX’e MIC’sini belirlemek için yayınlanan agar seyreltme yöntemi uygulanmıştır. Belirli bir bakteri suşuna karşı belirli bir antibiyotiğin MIC’si, et suyu seyreltme yöntemi24 ile de belirlenebilir. MIC tayini için plakaların hazırlanması5 mg OFX’i 1 mL ultra saf suda çözerek deneylerde kullanılan antibiyotik için bir ana stok çözeltisi hazırlayın. OFX’in çözünürlüğünü artırmak için 20 μL% 37 HCl ekleyin. 100 mL steril LB agarını eritin ve katılaşmayı önlemek için 55 °C’de tutun. Altı küçük cam şişe (25 mL) hazırlayın ve steril bir pipet kullanarak her şişeye 5 mL sıvı LB agar ortamı pipetin. 5 mg·mL-1 OFX ana stok çözeltisinin 10 μL’sini 90 μL ultra saf su içinde seyreltin (ana stokun 1:10 seyreltilmesi). Son konsantrasyonları 0 μg·mL−1, 0,02 μg·mL−1, 0,04 μg·mL−1 nihai konsantrasyonlarda LB agar ortamı üretmek için 5 mL LB agar ortamı içeren altı cam şişenin her birine 500 μg·mL-1 OFX çözeltisinden 0 μL, 2 μL, 4 μL, 6 μL, 8 μL veya 10 μL 500 μg·mL-1 çözeltisinin 10 μL’sini ekleyin, Sırasıyla 0,06 μg·mL−1, 0,08 μg·mL−1 ve 0,1 μg·mL-1 OFX. Şişeleri birkaç kez döndürerek çözeltiyi karıştırın.NOT: İlgili antibiyotiğin MIC’si biliniyorsa, konsantrasyon aralığı gerçek MIC’nin aşağıdan üstüne ulaşmalıdır. MIC bilinmiyorsa, log2 seyreltme serisine sahip geniş bir konsantrasyon aralığı önerilir. Antibiyotik eklemeden önce LB agar ortamının soğuduğundan emin olun, çünkü yüksek sıcaklıklar onu etkisiz hale getirebilir. Bununla birlikte, antibiyotiği eklemeden önce LB agar ortamının katılaşmasına izin vermemek önemlidir, çünkü bu, antibiyotiğin LB agar ortamında homojen olmayan dağılımına yol açabilir. Adım 2.1.3’te hazırlanan altı LB agar ortamının her birinin 5 mL’sini doz artırıcı bir şekilde steril bir pipet kullanarak 6 delikli bir kültür plakasına dökün. Agarın katılaşana kadar soğumasını bekleyin ve kullanmadan önce plakayı kurutun.NOT: Antibiyotik solüsyonunu ve kültür plakasını tahlilin yapıldığı gün hazırlayın. MIC belirleme testiBir cam tüp (≥25 mL) içinde izole bir koloni ile 5 mL LB ortamını aşılayın ve cam tüpü gece boyunca 37 ° C ve 180 rpm’ye (15 saat ile 19 saat arasında) ayarlanmış bir sallama inkübatörüne yerleştirin. Ertesi sabah, OD600 nm’yi ölçün ve kültürü PBS’de 1 x 107 CFU · mL-1’lik bir son hücre yoğunluğuna kadar bir test tüpüne seyreltin. Burada test edilen suşlar için, 1 x 107 CFU · mL − 1 , 0.0125’lik bir OD600 nm’ye karşılık gelir.NOT: CFU·mL-1 ve OD 600 nm arasındaki korelasyon bilinmiyorsa, CFU·mL-1 ve OD600 nm arasındaki korelasyon faktörünü hesaplamak için CFU ve OD600 nm ölçümleri ile belirlenen büyüme eğrisi oluşturulmalıdır. Daha önce seyreltilmiş kültürün 2 μL’sini kurutulmuş 6 delikli plakanın her bir kuyucuğuna yerleştirin. Plakayı gece boyunca 37 ° C’de (15 saat ile 19 saat arasında) bir inkübatöre yerleştirmeden önce lekelerin kurumasını bekleyin. Ertesi gün, her kuyuda oluşan kolonileri sayın. MIC, bakteri üremesinin tespit edilmediği minimum antibiyotik konsantrasyonuna sahip kuyuya karşılık gelir. 3. Nokta testi NOT: Nokta tahlili yöntemi, canlı hücrelerin (antibiyotik stresinden sonra koloni üretebilen hücreler) sayısının tahmin edilmesini sağlayan kalitatif bir yaklaşımdır. Nokta tahlili, test edilen koşullarda kullanılan suşun yaşayabilirliği hakkında fikir vermek ve zaman öldürme testi sırasında ihtiyaç duyulan seyreltmeler hakkında bilgi vermek için zaman öldürme testinden önce gerçekleştirilir (bkz. bölüm 4). LB agar plakalarını spot tahlillere hazırlamak için, kare bir Petri kabına (144cm2) 50 mL LB agar dökün. Her zaman noktası için bir kare Petri kabı hazırlayın. LB agarının katılaşmasına izin verin ve kullanmadan önce plakaları kurutun. 5 mL ortamı (MOPS glukoz% 0.4) bir cam tüp (≥25 mL) içinde izole bir koloni ile aşılayın ve tüpü gece boyunca 37 ° C ve 180 rpm’ye ayarlanmış bir sallama inkübatörüne yerleştirin (15 saat ile 19 saat arasında). Ertesi gün, OD 600 nm’yi ölçün ve kültürü taze sıcaklık ayarlı ortama (37 ° C, MOPS gliserol% 0.4) bir cam tüp (≥25 mL) içinde ~ 0.001’lik nihai bir OD600 nm’ye kadar seyreltin. Kültürün bir inkübatörde bir gecede 37 ° C’de 180 rpm’de (15 saat ile 19 saat arasında) büyümesine izin verin. Ertesi gün, OD600 nm’yi ölçün ve kültürü 0,3’lük son OD600 nm’ye kadar inkübe edin. İnkübasyon sırasında, ilk sıradaki (satır A) kuyucuklar hariç her kuyucuğa 90 μL 0.01 M MgSO4 çözeltisi yerleştirerek 96 kuyucuklu plakalar hazırlayın. 96 delikli plakalar, adım 3.7’de 10 kat seri seyreltme için kullanılacaktır.NOT: Bu deneyde, iki suş (wt ve hupA-mCherry suşu) yedi farklı zaman noktasında üçlü olarak test edilmiştir. Bir plaka 12 sütundan oluştuğundan, bir plaka iki zaman noktası için kullanılabilir ve böylece toplam dört plaka hazırlanmıştır. 0.3’lük bir OD600 nm’de , her bakteri kültürünün 200 μL’sini geri çekin. Bu örnekler, antibiyotik tedavisinden önceki t0 (tedavi edilmemiş) zaman noktasına karşılık gelir ve antibiyotik tedavisinden önce CFU · mL-1’in belirlenmesine izin verir. Numuneleri 3 dakika boyunca 2.300 x g’de santrifüjleyin. Santrifüjleme süresi boyunca, sıvı kültüre istenen OFX konsantrasyonunu ekleyin ve çalkalama sırasında 37 ° C’de inkübe etmeye devam edin.NOT: Burada, OFX 5 μg · mL-1 konsantrasyonunda kullanılmıştır (MIC’nin 83 kat çarpımına karşılık gelir). Önceki bir çalışmada, bu konsantrasyon OFX maruziyeti25 altındaki kalıcılık fenomenini karakterize etmek için kullanılmıştır. Zaman / öldürme testleri için kullanılan antibiyotik konsantrasyonu, antibiyotik, kültür ortamı ve bakteri üreme durumuna bağlı olarak değişebilir. Santrifüjlemeden sonra, hücre peletini 200 μL 0.01 M MgSO4 çözeltisi içinde yeniden askıya alın. Adım 3.5’te hazırlanan 96 delikli plakanın boş kuyucuğuna 100 μL yerleştirin. A sırasındaki kuyunun 10 μL’sini, 90 μL 0,01 M MgSO4 içeren B sırasındaki kuyuya aktararak bir seyreltme gerçekleştirin. B sırasındaki kuyunun 10 μL’sini C sırasındaki kuyuya aktararak seri seyreltmelere devam edin. 10−7’lik bir seyreltmeye ulaşana kadar tekrarlayın (her transfer 10 kat seyreltme ile).NOT: Bu deneyde, her zaman noktası için altı kültür ( wt suşu için üç ve hupA-mCherry suşu için üç) test edilmiştir. Protokole göre, altı suşun seri seyreltmelerini aynı anda gerçekleştirmek için çok kanallı bir pipet kullanılır. Teknik hatayı en aza indirmek için pipet uçları her transfer arasında değiştirilir. Adım 3.1’de hazırlanan LB agar plakaları üzerine her seyreltmenin 10 μL’sini tespit edin.NOT: Çok kanallı pipet, altı kültür için aynı seyreltmeyi (ör. 10-4 seyreltme) aynı anda tespit etmek için kullanılır. Tespit sırasında, çok kanallı pipetin ilk durağı, ikinci durağa itmeden kullanılmalıdır, çünkü bu, mikrodamlacıkların plakaya dağıtılmasına neden olabilir. Antibiyotik ilavesinden sonraki ilgili zaman noktalarında, kültürün 200 μL’sini geri çekin ve adım 3.8’de açıklandığı gibi seri seyreltmeler gerçekleştirin. Adım 3.9’da açıklandığı gibi her seyreltmenin 10 μL’sini tespit edin.NOT: Burada açıklanan deney için yedi zaman noktası toplanmıştır (t0, t1h, t2h, t3h, t4h, t5h, t6h). WT’ye kıyasla artmış antibiyotik duyarlılığı sergileyen suşlar için, artık antibiyotikleri çıkarmak için MgSO4 0.01 M’de çoklu yıkamalar yapılabilir. Plakaları gece boyunca 37 ° C’de inkübe edin (15 saat ile 19 saat arasında). Ertesi gün, kolonilerin tespit edilebileceği en yüksek iki seyreltmedeki koloni sayısını sayın. İdeal olarak, bu seyreltmeler için agar plakaları üzerindeki noktalar, her numune için CFU · mL-1’in doğru bir şekilde belirlenmesini sağlayan 3 ila 30 koloni içerir. Her zaman noktasının hesaplanan CFU·mL-1’ini, t0’daki başlangıç popülasyonunun CFU·mL-1’ine bölerek hayatta kalma oranını hesaplayın. 4. Zaman öldürme testleri NOT: Spot tahliller, belirli bir antibiyotik için belirli bir suşun hayatta kalma oranını tahmin etmek için kullanımı kolay bir yöntem olsa da, zaman öldürme testleri daha yüksek çözünürlüklü bir hayatta kalma oranı verir ve bakteriyel canlılığı doğru bir şekilde ölçmek için gerçekleştirilir. Öldürme eğrisinin profili, belirli bir bakteri suşunun belirli bir durumda antibiyotiğe duyarlı, toleranslı veya dirençli olup olmadığını belirlemek için kullanılabilir. Dahası, zaman öldürme testleri, kalıcılık fenomenini (bifazik öldürme eğrisinin ikinci eğiminin başlangıcı) ve kalıcılık sıklığını tespit etmek için gereken antibiyotik maruziyet zamanının belirlenmesine izin verir. Zaman öldürücü kaplama testi için LB agar plakaları hazırlayın. Bir Petri kabına (±57cm2) 25 mL LB agar dökün. Zaman noktası başına en az iki Petri kabı hazırlayın (gerinim başına zaman noktası başına iki seyreltme kaplanır). LB agarının katılaşmasına izin verin ve her plakaya beş ila sekiz steril cam boncuk eklemeden önce plakaları kurutun. Plakaları gerinim/durum/zaman noktasına göre ters çevirin ve etiketleyin.NOT: Cam boncuklar, adım 4.7 ve adım 4.9 sırasında bakterilerin agar plakalarına yayılmasına izin verir. Alternatif olarak, hücreler bir yayıcı kullanılarak agar plakası üzerinde dağıtılabilir. Her numune için, 900 μL 0,01 M MgSO4 çözeltisi içeren 10 katlı seri seyreltme cam tüpleri hazırlayın. Hazırlanması gereken numune başına seyreltme cam tüplerinin sayısı, nokta tahlilindeki kolonileri tespit etmek için gereken seyreltmelere karşılık gelir. 5 mL ortamı (MOPS glukoz% 0.4) bir cam tüp (≥25 mL) içinde izole bir koloni ile aşılayın ve tüpü gece boyunca 37 ° C ve 180 rpm’ye ayarlanmış bir sallama inkübatörüne yerleştirin (15 saat ile 19 saat arasında). 16 saatlik büyümeden sonra, OD 600 nm’yi ölçün ve kültürü bir cam tüp içinde taze sıcaklık ayarlı ortama (37 ° C, MOPS gliserol% 0.4) ~ 0.001 nihai OD600 nm’ye kadar seyreltin. Kültürün bir inkübatörde bir gecede 37 ° C’de 180 rpm’de (15 saat ile 19 saat arasında) büyümesine izin verin. Ertesi gün, OD600 nm’yi ölçün ve kültürü 0,3’lük son OD600 nm’ye kadar inkübe edin. 0.3’lük bir OD 600 nm’de, kültürün 100 μL’sini geri çekin, spot tahlilde elde edilen verilere göre seyreltin (0.3’lük bir OD600 nm’de ve antibiyotiksiz, 10−5 seyreltme genellikle 200-300 koloni verir) ve 4.1-4.2 adımlarında hazırlanan LB agar plakalarında100 μL plaka. Boncukların çanak kenarlarına temas etmesini önlemek için plakaları hafifçe sallayın, çünkü bu, bakteri hücrelerinin LB agar ortamına homojen olmayan bir şekilde yayılmasına neden olabilir. Antibiyotik tedavisinden önceki bu ilk örnek, t0 zaman noktasına karşılık gelir (antibiyotik tedavisinden önce CFU · mL-1). İstenilen OFX konsantrasyonunu ekleyin ve sallarken 37 ° C’de inkübe etmeye devam edin.NOT: Burada, OFX 5 μg · mL-1 konsantrasyonunda kullanılmıştır (MIC’nin 83 kat çarpımına karşılık gelir). Antibiyotik ilavesinden sonra ilgili zaman noktalarında, kültürün 100 μL’sini geri çekin, nokta tahlilinde elde edilen verilere göre seyreltin ve 4.1-4.2 adımlarında hazırlanan LB agar plakaları üzerinde 100 μL plaka plakası. Hücreleri adım 4.7’de açıklandığı gibi plakalayın.NOT: Burada açıklanan deney için yedi zaman noktası toplanmıştır (t0, t1h, t2h, t3h, t4h, t5h, t6h). Wt’ye kıyasla artmış antibiyotik duyarlılığı sergileyen suşlar için, artık antibiyotikleri çıkarmak için MgSO4 0.01 M’de çoklu yıkamalar yapılabilir. Plakaları gece boyunca 37 ° C’de inkübe edin (15 saat ile 19 saat arasında). Ertesi gün, kolonilerin tespit edilebileceği en yüksek iki seyreltmedeki koloni sayısını sayın. İdeal olarak, plakalar, her numunede CFU · mL-1’in doğru bir şekilde belirlenmesini sağlamak için 30-300 koloni içermelidir. CFU·mL-1’i her zaman noktasında CFU·mL-1 ile t0’da normalleştirerek hayatta kalma oranını hesaplayın. Günlük10 normalleştirilmiş CFU·mL-1’i zamanın bir fonksiyonu olarak çizin. 5. Mikroakışkan hızlandırılmış mikroskopi görüntüleme NOT: Aşağıdaki bölümde, mikroakışkan plakanın hazırlanmasının yanı sıra hızlandırılmış görüntü toplama ve görüntü analizi prosedürü açıklanmaktadır. Bu deneyin amacı, antibiyotik tedavisi üzerine kalıcılık fenotipini tek hücre düzeyinde gözlemlemek ve analiz etmektir. Bu deney sırasında toplanan veriler, ele alınan soruya ve / veya deney sırasında kullanılan floresan muhabirlerine bağlı olarak çok çeşitli sonuçlar üretmek için kullanılabilir. Burada açıklanan deneyde, hücre uzunluğunun ve HU-mCherry floresan22’nin, persister ve persister olmayan hücrelerdeki nükleoid organizasyonunu yansıtan kantitatif analizi yapılmıştır. Mikroakışkan hızlandırılmış mikroskopi için bakteriyel hücre kültürüBir cam tüp (≥25 mL) içinde izole bir koloni ile 5 mL ortamı (MOPS gliserol% 0.4, gerekirse seçici bir antibiyotik ile desteklenmiş) aşılayın ve tüpü gece boyunca 37 ° C ve 180 rpm’ye (15 saat ile 19 saat arasında) ayarlanmış bir sallama inkübatörüne yerleştirin. Ertesi gün, OD 600 nm’yi ölçün ve kültürü taze sıcaklık ayarlı ortamda (37 ° C, MOPS gliserol% 0.4) bir cam tüp içinde ~ 0.001’lik nihai bir OD600 nm’ye kadar seyreltin. Ertesi gün erken bir üstel faz kültürü elde etmek için kültürün gece boyunca (15 saat ile 19 saat arasında) 37 ° C ve 180 rpm’de sallanan bir inkübatörde büyümesine izin verin. Mikroakışkan plağın hazırlanması ve hızlandırılmış mikroskopi görüntülemeNOT: Mikroakışkan deneyler, ticari olarak temin edilebilen mikroakışkan cihazlarda (burada açıklandığı gibi) veya şirket içinde üretilen mikroakışkan sistemlerde gerçekleştirilebilir.Koruma çözeltisini (varsa) mikroakışkan plakanın her bir kuyucuğundan çıkarın ve taze bir kültür ortamı ile değiştirin.NOT: Mikroakışkan plaka bir atık çıkış kuyusu içeriyorsa, çıkış kuyusunun koruma çözeltisi çıkarılmalı, ancak ortam ile değiştirilmemelidir. Mühürle düğmesine tıklayarak veya mikroakışkan yazılım aracılığıyla mikroakışkan plakayı manifold sistemi ile kapatın (önce Alet’i seçin, ardından Sızdırmazlık Plakası’nı seçin).NOT: Plakayı kapatmak için, plakayı manifolda karşı manuel olarak sıkarak plakaya ve manifolda eşit bir basınç uygulanmalıdır. Doğru şekilde gerçekleştirilirse, ONIX2 arayüzünde “mühürlü” notu görünmelidir. Manifoldun kırılma riskini önlemek için cam kızağa herhangi bir basınç uygulamamak önemlidir. Mühürlendikten sonra, ilk astarlama sırasını gerçekleştirin (mikroakışkan yazılım arayüzünde Run Liquid Priming Sequence’a (Sıvı Astarlama Sırasını Çalıştır ) tıklayın).NOT: Sıvı Besleme Dizisini Çalıştır , 1-5 kuyuları için 6,9 kPa’da 5 dakikalık perfüzyona, ardından kuyu 8 için 6,9 kPa’da 5 dakikalık perfüzyona ve 6,9 kPa’da 5 dakika boyunca kuyu 6 için son perfüzyon turuna karşılık gelir. Çalışma Sıvısı Astarlama Sekansı , farklı kuyucukları birbirine bağlayan kanallarda hala mevcut olabilecek koruma çözeltisinin uzaklaştırılmasını sağlar. Plakayı, mikroskop görüntülemenin başlamasından önce en az 2 saat boyunca istenen sıcaklıkta (burada, 37 ° C) mikroskobun termostatik olarak kontrol edilen bir kabininde inkübe edin. Denemeye başlamadan önce ikinci bir Sıvı Hazırlama Sırası Çalıştır başlatın. Mikroakışkan yazılım arayüzünde Mühürle kapat’a tıklayarak mikroakışkan plakayı kapatın. Ortamı kuyu 1 ve kuyu 2’de 200 μL taze ortamla, kuyu 3’te antibiyotik içeren 200 μL taze ortamla (burada, 5 μg · mL−1’de OFX), kuyu 4’te ve kuyu 5’te 200 μL taze ortamla, kuyu 6’da 200 μL taze ortamla ve kuyu 8’de 200 μL kültür örneğinle (adım 5.1.2’den itibaren) bir OD600 nm’ye seyreltilmiş olarak değiştirin taze ortamda 0.01’dir. Mikroakışkan plakayı adım 5.2.2’de açıklandığı gibi kapatın ve plakayı mikroskop dolabının içindeki mikroskop hedefine yerleştirin.NOT: Mikroakışkan plakayı yerleştirmeden önce mikroskop hedefine bir damla daldırma yağı koyduğunuzdan emin olun. Mikroakışkan yazılımda, hücrenin mikroakışkan plakaya yüklenmesine izin vermek için Hücre Yükleme’ye tıklayın.NOT: Hücre Yükleme adımı, kuyu 8 için 13,8 kPa’da 15 s perfüzyon, ardından kuyu 6 ve kuyu 8 için 27,6 kPa’da 15 s perfüzyon ve 6,9 kPa’da 30 s için kuyu 6 için son perfüzyon turundan oluşur. Mikroakışkan plakadaki hücrelerin yoğunluğu deney için kritik öneme sahiptir. Bu mikroakışkan protokolün ilk kısmı, antibiyotik tedavisinden önce taze bir ortamda 6 saat boyunca büyüyen bakterilerden oluşur. 6 saatlik büyümeden sonra, hücre yoğunluğu nadir persister hücreleri tespit etmek için yeterli olmalıdır (bu çalışmada kullanılan koşullarda, persister hücreler 10-4 frekansında üretilir). Hücre yoğunluğu çok yüksekse, tek tek hücreleri ayırt etmek zordur, bu da hassas tek hücreli analizi önler. Büyüme hızı doğrudan ortama bağlı olduğundan, deneyi başlatmadan önce mikroskopi alanlarındaki hücrelerin yoğunluğu değerlendirilmelidir. İletilen ışık modunu kullanarak optimum bir odak ayarlayın ve uygun bir hücre numarasının gözlemlendiği birkaç ilgi alanı (ROI) seçin (alan başına 300 hücreye kadar).NOT: Nadir kalıcı hücrelerin görüntülendiğinden emin olmak için en az 40 YG seçin. Mikroakışkan yazılımda, Protokol Oluştur’a tıklayın. Taze ortamın 6 saat boyunca 6.9 kPa’da enjeksiyonunu programlayın (kuyu 1-2), ardından antibiyotiği içeren ortamın 6 saat boyunca 6.9 kPa’da enjeksiyonu (kuyu 3) ve son olarak, taze ortamın 20 saat boyunca 6.9 kPa’da enjeksiyonu (kuyu 4-5).NOT: 0.01’lik bir OD600 nm’ye seyreltilmiş bir bakteri kültürü, bakterilerin mikroakışkan odada 6 saat boyunca büyümesine izin vererek hücrelerin üstel büyüme fazında olmasını sağlar. Yükleme adımı sırasında mikroakışkan cihaza sokulan hücre sayısına bağlı olarak (bkz. adım 5.2.8), büyüme fazının süresi, ROI başına 300 hücreye kadar elde edilecek şekilde uyarlanabilir. Kalıcılık nadir görülen bir fenomen olduğundan, ROI başına hücre sayısının arttırılması, kalıcı hücreleri gözlemleme olasılığını artırır. Bununla birlikte, hücre sayısı, ROI başına 300 hücreyi geçmemelidir, çünkü bu, tek hücreli analizi sıkıcı hale getirir. İletilen ışığı ve floresan muhabir için uyarma ışık kaynağını kullanarak her 15 dakikada bir kare ile hızlandırılmış modda mikroskopi görüntüleme gerçekleştirin. Burada, mCherry sinyali için 560 nm uyarma ışık kaynağı kullanıldı (filtre 00 [530-585 ex, 615LP em, Zeiss] ile% 10 güçte 580 nm LED ve mCherry için 100 ms pozlama). Hücre görüntülemesi için Zeiss uyumlu Zen3.2 yazılımı kullanıldı. Görüntü analiziNOT: Mikroskopi görüntülerinin açılması ve görselleştirilmesi açık kaynaklı ImageJ/Fiji yazılımı (https://fiji.sc/)26 ile gerçekleştirilir. Kantitatif görüntü analizi, açık kaynaklı ImageJ/Fiji yazılımı ve ücretsiz MicrobeJ eklentisi (https://microbej.com)27 kullanılarak gerçekleştirilir. Bu protokolde MicrobeJ 5.13I(14) versiyonu kullanılmıştır.Bilgisayarda ImageJ/Fiji yazılımını açın ve hiper yığın hızlandırılmış mikroskopi görüntülerini Fiji yükleme çubuğuna sürükleyin. Hiperstack’in farklı kanallarını birleştirmek için Image > Color > Make Composite’i kullanın. Hızlandırılmış denemenin kanalları istenen renge karşılık gelmiyorsa (ör. faz kontrastı gri yerine kırmızı renkle gösteriliyorsa), kanallara uygun rengi uygulamak için Görüntü > Renk > Kanalları Düzenle’yi kullanın. MicrobeJ eklentisini açın ve manuel düzenleme arayüzünü kullanarak bakteri hücrelerini tespit edin. Otomatik olarak algılanan hücreleri silin ve ilgilenilen kalıcı hücreleri kare kare el ile ana hatlarıyla belirtin.NOT: Tek tek hücreleri otomatik olarak algılamak için farklı ayarlar kullanılabilir. Analiz edilen persister hücreler, otomatik algılama kullanılarak nadiren doğru bir şekilde tespit edilen uzun filamentler oluşturduğu için burada manuel algılama kullanılmıştır. Algılamadan sonra, bir ResultJ tablosu oluşturmak için MicrobeJ manuel düzenleme arayüzündeki Sonuç simgesini kullanın. ResultJ dosyasını kaydedin ve tek hücreli analizin ilgilendiği farklı parametreler hakkında içgörüler elde etmek için ResultJ tablosunu kullanın. Bu protokol durumunda, HU-mCherry yoğunluğunun, hücre uzunluğunun ve bireysel hücrelerin hücre alanının ortalama floresansı ihraç edildi.