大腸菌における抗生物質持続性の集団および単一細胞解析

注:滅菌培養ガラス器具、ピペットチップ、および成長培地を使用してください。ここで、 大腸菌 細胞は、低自家蛍光化学的に規定された培地中で増殖させた( 材料の表を参照されたい)。接種は、汚染のリスクを最小限に抑えるためにブンゼンバーナーの存在下で行われました。 1. 細胞培養と成長曲線 Luria-Bertaini(LB)寒天プレート(必要に応じて選択的抗生物質を補充)上の凍結グリセロールストックから目的の株をストリークし、37°Cで一晩(15時間から19時間の間)インキュベートして単一のコロニーを得ます。注:ここで紹介する実験では、wt株に対応する大腸菌K-12 MG1655と同質遺伝子MG1655 hupA-mCherry株22の2つの株を使用します。後者の株は、HUヌクレオイド関連タンパク質の蛍光タグ付きαサブユニットを発現する。hupA-mCherryレポーターは、hupAのネイティブ遺伝子座に統合されています。HU-mCherryは、非特異的な方法でDNAに結合する生細胞の核様体動態を追跡するためのプロキシとして機能します。 5mLの培地(ここでは、3-[N-モルホリノ]プロパンスルホン酸系培地[MOPS];表1、表2、および表3)にグルコース0.4%および選択的抗生物質(必要な場合)を添加し、単離コロニーをガラスチューブ(≥25mL)に入れ、チューブを37°Cに設定した振とうインキュベーターに入れ、一晩(15時間から19時間の間)毎分180回転(rpm)した。あるいは、ガラスチューブの代わりにプラスチックチューブ、ガラス、またはプラスチックフラスコ(≥25mL)を使用することができる。注:最終濃度0.4%のグリセロールを添加したMOPS培地は、MOPSグルコース0.4%で行われた一晩培養を除いて、この論文に記載されている実験全体で使用されました。グルコースを添加したMOPSにおける 大腸菌 の生成時間は、MOPSグリセロールにおけるそれよりも短い。このステップでMOPSグリセロール0.4%の代わりにMOPSグルコース0.4%を使用すると、細胞が19時間以内に固定期に到達することが保証されます。M9または異なる炭素源を添加したリッチ定義培地(RDM)などの他の増殖培地も使用することができる。しかしながら、成長率および持続頻度は、使用される培地および/または炭素によって異なることに注意すべきである23。 翌朝、培養液1 mLを2,300 x gで3分間遠心分離し、上清を捨て、ペレットを同容量のリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に静かに再懸濁します。600 nm(OD 600 nm)での光学密度を測定し、最終容量2 mLで0.01の初期OD600 nmに必要な容量を計算します。 2 mLのMOPSグリセロール0.4%培地を透明な底部24ウェルプレートのウェルに入れ、計算した一晩培養量を接種します。24ウェルプレートを自動マイクロプレートリーダー( 材料の表を参照)に入れて、OD600 nm を24時間監視します。マイクロプレートリーダーをセットして、37°Cの温度と高い軌道回転(140rpm)で15分ごとにOD600nm を測定します。注:実験で使用された菌株が蛍光レポーターをコードする場合、増殖速度は抗生物質の持続頻度に影響を与えるため、後続の実験でのアーティファクトを回避するために、その成長率が wt の成長率に匹敵することを確認してください23。非常に低い細胞密度での検出には限界があり、OD600 nm/コロニー形成単位(CFU)の関係に対する潜在的な株特異的な影響があるため、特性評価されていない株で作業する場合は、CFU·mL-1 を監視して増殖動態を評価することをお勧めします。 2.抗生物質の最小阻害濃度の決定 注:最小阻害濃度(MIC)は、細菌の増殖が観察されない抗生物質の最低用量として定義されます。.MICの決定は、抗生物質および株ごとに実行する必要があります。ここに記載の実験では、フルオロキノロン系抗生物質オフロキサシン(OFX)を使用した。MICの決定により、抗生物質溶液が正しく調製され、抗生物質が活性であり、株が抗生物質に対して同等に感受性であることを確認できます。ここでは、公開された寒天希釈法を用いて、使用した異なる菌株のMIC乃至OFXを決定した24。所与の細菌株に対する所与の抗生物質のMICは、ブロス希釈法24を介して決定することもできる。 MIC測定のためのプレートの準備実験で使用した抗生物質の原液は、OFX5mgを超純水1mLに溶解して調製します。OFXの溶解度を高めるために、37%HClを20μL添加します。 100 mLの滅菌LB寒天培地を溶かし、固化を避けるために55°Cに保ちます。6つの小さなガラスフラスコ(25 mL)を準備し、滅菌ピペットを使用して各フラスコに5 mLの液体LB寒天培地をピペットで入れます。 5 mg·mL-1 OFXマスターストック溶液10 μLを超純水90 μLで希釈します(マスターストックの1:10希釈)。5 mLのLB寒天培地を含む6つのガラスフラスコのそれぞれに0 μL、2 μL、4 μL、6 μL、8 μL、または10 μLの500 μg·mL-1 OFX溶液を加え、最終濃度0 μg・mL−1、0.02 μg・mL−1、0.04 μg・mL−1のLB寒天培地を生成します。 それぞれ0.06 μg·mL-1、0.08 μg·mL-1、および0.1 μg·mL-1 OFXです。フラスコを数回回転させて溶液を混合する。注:目的の抗生物質のMICがわかっている場合、濃度の範囲は実際のMICの下から上に達する必要があります。MICが不明な場合は、log2 希釈系列を使用した広範囲の濃度が推奨されます。抗生物質を添加する前に、LB寒天培地が冷えていることを確認してください。それにもかかわらず、抗生物質を添加する前にLB寒天培地を固化させないことは、LB寒天培地中の抗生物質の不均一な分布につながる可能性があるため、重要です。 ステップ 2.1.3 で調製した 6 つの LB 寒天培地のそれぞれ 5 mL を、滅菌ピペットを使用して用量を増加させる方法で 6 ウェル培養プレートに注ぎます。寒天が固まるまで冷まし、プレートを乾かしてからご使用ください。注:抗生物質溶液と培養プレートをアッセイ実施当日に調製します。 MIC測定アッセイ5 mLのLB培地に単離されたコロニーをガラス管(≥25 mL)に接種し、ガラス管を37°Cおよび180 rpmに設定された振とうインキュベーターに一晩(15時間から19時間の間)入れます。 翌朝、OD600 nmを測定し、培養液をPBS中で最終細胞密度1 x 107 CFU・mL-1 に試験管に希釈した。ここでテストした菌株の場合、1 x 107 CFU·mL−1 は0.0125のOD600 nm に相当します。注:CFU·mL-1とOD 600 nmの相関が不明な場合は、CFU·mL-1とOD600 nmの相関係数を計算するために、CFUとOD600 nmの測定によって決定された成長曲線を確立する必要があります。 以前に希釈した培養液を2 μL、乾燥した6ウェルプレートのすべてのウェルにスポットします。プレートを37°Cのインキュベーターに一晩(15時間から19時間の間)入れる前に、スポットを乾燥させます。 翌日、各ウェルに形成されたコロニーを数えます。MICは、細菌の増殖が検出されない抗生物質の最小濃度のウェルに対応します。 3. スポットアッセイ 注:スポットアッセイ法は、生細胞(抗生物質ストレス後にコロニーを生成できる細胞)の数を推定できる定性的アプローチです。スポットアッセイは、タイムキルアッセイの前に実行され、テストされた条件で使用される菌株の生存率に関する洞察を提供し、タイムキルアッセイ中に必要な希釈について通知します(セクション4を参照)。 スポットアッセイ用のLB寒天プレートを調製するには、50 mLのLB寒天を正方形のペトリ皿(144 cm2)に注ぎます。時間ポイントごとに1つの正方形のペトリ皿を準備します。LB寒天を固め、プレートを乾燥させてから使用してください。 5 mLの培地(MOPSグルコース0.4%)に単離されたコロニーをガラスチューブ(≥25 mL)に接種し、チューブを37°Cおよび180 rpmに設定された振とうインキュベーターに一晩(15時間から19時間の間)置きます。 翌日、OD600 nmを測定し、培養液をガラスチューブ(≥25 mL)中の新鮮な温度調整培地(37°C、MOPSグリセロール0.4%)に希釈して、最終的なOD600 nm ~0.001にしました。培養液をインキュベーター内で37°C、180 rpm(15時間から19時間の間)で一晩増殖させます。 翌日、OD600 nmを測定し、0.3の最終OD600 nmになるまで培養液をインキュベートした。 インキュベート中に、90 μLの0.01 M MgSO4 溶液を最初の列(行A)を除くすべてのウェルに配置して、96ウェルプレートを調製します。96ウェルプレートは、ステップ3.7で10倍の段階希釈に使用されます。注:この実験では、2つの株(wt および hupA-mCherry 株)を7つの異なる時点で三重に試験した。1枚のプレートは12列で構成されているため、1枚のプレートを2つの時点に使用でき、合計4枚のプレートを用意しました。 OD600 nm が 0.3 の状態で、各細菌培養物 200 μL を回収します。これらのサンプルは、抗生物質治療前のt0(未処理)時点に対応し、抗生物質治療前のCFU・mL-1 の決定を可能にします。 サンプルを2,300 x g で3分間遠心分離します。遠心分離時間の間に、液体培養物に所望の濃度のOFXを添加し、振とうしながら37°Cでインキュベートを続ける。注:ここでは、OFXは5μg・mL-1 の濃度で使用されました(MICに83倍を掛けたものに相当)。以前の研究では、この濃度はOFX曝露下での持続現象を特徴付けるために使用されました25。タイム/キルアッセイに使用される抗生物質濃度は、抗生物質、培地、および細菌の増殖状態によって異なります。 遠心分離後、細胞ペレットを200 μLの0.01 MMgSO4 溶液に再懸濁します。ステップ3.5で調製した96ウェルプレートの空のウェルに100μLを入れます。A列目のウェル10 μLを、0.01 M MgSO4を90 μLの0.01 M MgSO4を含むB行目のウェルに移して希釈を行います。10 μLのウェルをBのウェルをC列目のウェルに移して、段階希釈を続けます。10−7 の希釈に達するまで繰り返します(すべての転写は10倍希釈です)。注:この実験では、6つの培養物( wt 株に3つ、 hupA-mCherry 株に3つ)をすべての時点でテストしました。プロトコルに従って、マルチチャンネルピペットを使用して、6つの菌株の段階希釈を同時に実行します。技術的なエラーを最小限に抑えるために、ピペットチップは転送ごとに交換されます。 各希釈液の10 μLを、ステップ3.1で調製したLB寒天プレートにスポットします。注:マルチチャンネルピペットを使用して、6つの培養液に対して同じ希釈液(10-4 希釈など)を同時に見つけます。スポッティング中は、マイクロ液滴がプレートに分注される可能性があるため、マルチチャンネルピペットの最初のストップを2番目のストップを押さずに使用する必要があります。 抗生物質添加後の適切な時点で、200 μLの培養液を回収し、ステップ3.8に記載されているように段階希釈を実行します。ステップ3.9に記載されているように各希釈液を10μLスポットします。注:ここで説明する実験では、7つの時点(t0、t1h、t2h、t3h、t4h、t5h、t6h)が収集されました。wtと比較して増加した抗生物質感受性を示す株については 、 残留抗生物質を除去するためにMgSO4 0.01M中で複数回の洗浄を行うことができる。 プレートを37°Cで一晩(15時間から19時間)インキュベートします。翌日、コロニーを検出できる2つの最も高い希釈液でコロニーの数を数えます。理想的には、これらの希釈用の寒天プレート上のスポットには3〜30個のコロニーが含まれており、各サンプルのCFU・mL-1 を正確に測定できます。 各時点の計算されたCFU・mL-1をt0での初期母集団のCFU・mL-1で割ることによって生存率を計算します。 4. タイムキルアッセイ 注:スポットアッセイは、特定の抗生物質に対する特定の菌株の生存率を推定するための使いやすい方法ですが、タイムキルアッセイはより高い分解能の生存率を提供し、細菌の生存率を正確に定量するために実行されます。キリングカーブのプロファイルを使用して、特定の細菌株が特定の状態において抗生物質に対して感受性、耐性、または耐性であるかどうかを判断できます。さらに、タイムキルアッセイは、持続現象(二相性殺傷曲線の第2の傾きの始まり)および持続頻度を検出するために必要な抗生物質曝露の時間の決定を可能にする。 タイムキルめっきアッセイ用のLB寒天プレートを準備します。25 mLのLB寒天をペトリ皿(±57 cm2)に注ぎます。タイムポイントごとに少なくとも2つのペトリ皿を準備します(株ごとにタイムポイントごとに2つの希釈液をメッキします)。 LB寒天を固化させ、プレートを乾燥させてから、各プレートに5〜8個の滅菌ガラスビーズを追加します。ひずみ/条件/時点に従ってプレートを反転してラベルを付けます。注意: ガラスビーズは、ステップ4.7およびステップ4.9の間に寒天プレート上にバクテリアを拡散させます。あるいは、細胞は、スプレッダーを用いて寒天プレート上に分散させることができる。 各サンプルについて、900 μLの0.01 M MgSO4 溶液を含む10倍の段階希釈ガラス管を準備します。調製が必要なサンプルあたりの希釈ガラスチューブの数は、スポットアッセイでコロニーを検出するために必要な希釈液に対応します。 5 mLの培地(MOPSグルコース0.4%)に単離されたコロニーをガラスチューブ(≥25 mL)に接種し、チューブを37°Cおよび180 rpmに設定された振とうインキュベーターに一晩(15時間から19時間の間)置きます。 16時間の増殖後、OD 600 nmを測定し、培養液をガラス管内の新鮮な温度調整培地(37°C、MOPSグリセロール0.4%)に希釈して、最終的なOD600 nm~0.001にしました。培養液をインキュベーター内で37°C、180 rpm(15時間から19時間の間)で一晩増殖させます。 翌日、OD600 nmを測定し、0.3の最終OD600 nmになるまで培養液をインキュベートした。 OD 600 nmが0.3の状態で、培養物100 μLを回収し、スポットアッセイで得られたデータに従って希釈し(OD 600 nmが0.3で抗生物質なしの場合、10-5希釈で通常200〜300コロニーが得られる)、ステップ4.1〜4.2で調製したLB寒天プレート上に100 μLをプレートします。 ビーズが皿の端に接触しないようにプレートを静かに振ると、LB寒天培地上の細菌細胞が不均一に広がる可能性があります。抗生物質治療前のこの最初のサンプルは、t0時点(抗生物質治療前のCFU・mL-1)に対応します。 所望の濃度のOFXを加え、振とうしながら37°Cでインキュベートを続ける。注:ここでは、OFXは5μg・mL-1 の濃度で使用されました(MICに83倍を掛けたものに相当)。 抗生物質添加後の関連する時点で、培養物100 μLを回収し、スポットアッセイで得られたデータに従って希釈し、ステップ4.1〜4.2で調製したLB寒天プレート上に100 μLをプレートします。ステップ4.7の説明に従って細胞をプレートします。注:ここで説明する実験では、7つの時点(t0、t1h、t2h、t3h、t4h、t5h、t6h)が収集されました。 重量と比較して増加した抗生物質感受性を示す株については、残留抗生物質を除去するためにMgSO4 0.01 Mで複数回の洗浄を行うことができます。 プレートを37°Cで一晩(15時間から19時間)インキュベートします。翌日、コロニーを検出できる2つの最も高い希釈液でコロニーの数を数えます。理想的には、プレートには、各サンプル中のCFU·mL-1 を正確に測定できるように、30〜300個のコロニーが含まれている必要があります。 各時点でのCFU・mL-1をt0のCFU・mL-1で正規化して生存率を計算します。log10正規化CFU・mL-1を時間の関数としてプロットします。 5. マイクロ流体タイムラプス顕微鏡イメージング 注:次のセクションでは、マイクロ流体プレートの準備、タイムラプス画像の取得および画像解析手順について説明します。この実験の目的は、単一細胞レベルで抗生物質治療時の持続性表現型を観察および分析することです。この実験中に収集されたデータは、対処された質問および/または実験中に使用された蛍光レポーターに応じて、幅広い結果を生成するために使用できます。ここで説明する実験では、細胞長およびHU-mCherry蛍光22の定量的分析を行い、持続性細胞および非持続性細胞における核様体組織を反映して、行った。 マイクロ流体タイムラプス顕微鏡のための細菌細胞培養5 mLの培地(MOPSグリセロール0.4%、必要に応じて選択的抗生物質を添加した)を単離したコロニーをガラスチューブ(≥25 mL)に接種し、チューブを37°Cおよび180 rpmに設定された振とうインキュベーターに一晩(15時間から19時間の間)入れます。 翌日、OD 600 nmを測定し、ガラス管で培養液を新鮮な温度調整培地(37°C、MOPSグリセロール0.4%)で希釈して、最終的なOD600 nm~0.001とした。培養液を37°C、180rpmの振とうインキュベーターで一晩(15時間から19時間の間)増殖させ、翌日に初期の指数相培養物を得ました。 マイクロ流体プレートの作製とタイムラプス顕微鏡イメージング注:マイクロ流体実験は、市販のマイクロ流体デバイス(ここで説明)または自社で製造されたマイクロ流体システムで実行できます。マイクロ流体プレートのすべてのウェルから保存液(存在する場合)を取り出し、新鮮な培地と交換します。注意: マイクロ流体プレートに廃棄物出口ウェルが含まれている場合は、出口ウェルの保存液を除去する必要がありますが、培地で交換しないでください。 マニホールドシステムでマイクロ流体プレートをシールするには、シールボタンをクリックするか、マイクロ流体ソフトウェアを使用します(最初にツールを選択し、次にシールプレートを選択します)。 注意: プレートをシールするには、プレートをマニホールドに対して手動で絞って、プレートとマニホールドに均一な圧力をかける必要があります。正しく実行されると、「封印された」というメモがONIX2インターフェイスに表示されます。マニホールドを破損する潜在的なリスクを回避するために、スライドガラスに圧力をかけないことが重要です。 密封したら、最初のプライミングシーケンスを実行します(マイクロ流体ソフトウェアインターフェースの[ 液体プライミングシーケンスの実行 ]をクリックします)。注: 液体プライミングシーケンスの実行 は、ウェル1〜5の場合は6.9 kPaで5分間の灌流に相当し、ウェル8の場合は6.9 kPaで5分間の灌流、ウェル6の場合は6.9 kPaで5分間の最終灌流ラウンドに対応します。 ランリキッドプライミングシーケンス は、異なるウェルを接続するチャネルにまだ存在する可能性のある保存溶液の除去を可能にします。 顕微鏡イメージングを開始する前に、顕微鏡のサーモスタット制御キャビネットで希望の温度(ここでは37°C)でプレートを最低2時間インキュベートします。 実験を開始する前に、2回目の 液体プライミングシーケンスの実行 を開始します。 マイクロ流体ソフトウェアインターフェースの[シールオフ]をクリックして、マイクロ流体プレートをシールします。ウェル 1 とウェル 2 の培地を 200 μL の新しい培地に、ウェル 3 では抗生物質を含む新鮮な培地 200 μL (ここでは 5 μg·mL−1 の OFX)、ウェル 4 とウェル 5 では 200 μL のフレッシュ培地、ウェル 6 では 200 μL のフレッシュ培地、ウェル 8 では 200 μL の培養サンプル (ステップ 5.1.2 から) を外径600 nm に希釈した培地 (ここでは 5.1.2 から) を交換します。新鮮な培地で0.01の。 手順5.2.2の説明に従ってマイクロ流体プレートを密封し、顕微鏡キャビネット内の顕微鏡対物レンズにプレートを置きます。注:マイクロ流体プレートを配置する前に、顕微鏡対物レンズに液浸オイルを滴下してください。 マイクロ流体ソフトウェアで、[ セルローディング ]をクリックして、セルをマイクロ流体プレートにロードできるようにします。注: セルローディング ステップは、ウェル8の場合は13.8 kPaで15秒の灌流、続いてウェル6とウェル8の場合は27.6 kPaで15秒の灌流、ウェル6の場合は6.9 kPaで30秒間の最終灌流ラウンドで構成されます。マイクロ流体プレート内の細胞の密度は、実験にとって重要です。このマイクロ流体プロトコルの最初の部分は、抗生物質治療の前に新鮮な培地中で6時間細菌を増殖させることからなる。6時間の増殖後、細胞密度は希少な持続性細胞を検出するのに十分でなければなりません(この研究で使用された条件では、持続性細胞は10−4の頻度で生成されます)。細胞密度が高すぎると、個々の細胞を区別することが困難になり、正確な単一細胞解析が妨げられます。増殖速度は培地に直接依存するため、実験を開始する前に顕微鏡分野の細胞の密度を評価する必要があります。 透過光モードを使用して最適な焦点を設定し、適切なセル数が観察されるいくつかの関心領域(ROI)を選択します(フィールドあたり最大300セル)。注: 少なくとも 40 個の ROI を選択して、まれなパーシスタンサー セルがイメージ化されていることを確認します。 マイクロ流体ソフトウェアで、[ プロトコルの作成]をクリックします。新鮮な培地を6.9 kPaで6時間注入し(ウェル1-2)、続いて抗生物質を含む培地を6.9 kPaで6時間注入し(ウェル3)、最後に6.9 kPaで20時間新鮮な培地を注入します(ウェル4-5)。注:OD600 nm に0.01に希釈された細菌培養により、細菌はマイクロ流体チャンバー内で6時間増殖し、細胞が指数関数的成長段階にあることが保証されます。ローディングステップ(ステップ5.2.8を参照)中にマイクロ流体デバイスに導入された細胞の数に応じて、増殖段階の持続時間を調整して、ROIあたり最大300個の細胞を得ることができます。持続性はまれな現象であるため、ROIあたりの細胞数を増やすと、持続性細胞を観察する可能性が向上します。ただし、セル数は、シングルセル分析が面倒になるため、ROIあたり300セルを超えてはなりません。 透過光と蛍光レポーターの励起光源を使用して、15分ごとに1フレームのタイムラプスモードで顕微鏡イメージングを実行します。ここでは、mCherry信号用の560nm励起光源を使用しました(フィルター00[530-585 ex、615LP em、Zeiss]で10%の電力で580 nm LED、mCherryの場合は100ミリ秒の露光)。ツァイス互換のZen3.2ソフトウェアを細胞イメージングに使用しました。 画像解析注:顕微鏡画像のオープニングと視覚化は、オープンソースのImageJ/Fijiソフトウェア(https://fiji.sc/)26を使用して実行されます。定量的画像解析は、オープンソースのImageJ/Fijiソフトウェアと無料のMicrobeJプラグイン(https://microbej.com)27を使用して実行されます。このプロトコルでは、MicrobeJ 5.13I(14)バージョンが使用されました。コンピューターでImageJ/Fijiソフトウェアを開き、ハイパースタックタイムラプス顕微鏡画像をフィジーのローディングバーにドラッグします。 イメージ>カラー>コンポジットの作成を使用して、 ハイパースタックのさまざまなチャネルを融合します。タイムラプス実験のチャンネルが目的の色に対応していない場合(たとえば、位相差が灰色ではなく赤で表示される場合)は、[ 画像>カラー]>[チャンネルの配置 ]を使用して、チャンネルに適切な色を適用します。 MicrobeJプラグインを開き、手動編集インターフェイスを使用して細菌細胞を検出します。自動的に検出されたセルを削除し、目的の永続セルの輪郭をフレームごとに手動で作成します。注: 個々のセルを自動的に検出するために、さまざまな設定を使用できます。ここでは、分析された持続細胞が長いフィラメントを形成し、自動検出を使用して正しく検出されることはめったにないため、手動検出を使用しました。 検出後、MicrobeJ 手動編集インターフェイス の結果アイコンを使用して 、ResultJ テーブルを生成します。ResultJファイルを保存し、ResultJテーブルを使用して、シングルセル解析の対象となるさまざまなパラメータに関する洞察を得ます。このプロトコルの場合、HU-mCherry強度の平均蛍光、細胞長、および個々の細胞の細胞面積をエクスポートしました。