아르테미아 살리나 L을 사용한 치사율 생물학적 분석법
Summary
이 작업은 소금물 새우 치사 분석으로도 확인된 Artemia salina 치사율 생물학적 분석 절차를 평가하고 검토하는 것을 목표로 합니다. 이 간단하고 저렴한 방법은 샘플, 즉 천연물의 일반적인 독성 (예비 독성 평가로 간주 됨)에 대한 정보를 제공합니다.
Abstract
천연물은 고대부터 의약품을 생산하는 데 사용되어 왔습니다. 요즘에는 천연 자원에서 얻은 화학 요법 약물이 많이 있으며 과다한 질병에 사용됩니다. 불행히도, 이러한 화합물의 대부분은 종종 전신 독성 및 부작용을 나타냅니다. 선택된 잠재적 생리활성 샘플의 내약성을 더 잘 평가하기 위해, 염수 새우(Artemia salina)는 일반적으로 치사율 연구의 모델로서 사용된다. A. salina 테스트는 연구 된 생리 활성 화합물이 애벌레 단계 (nauplii)에서 미세 갑각류를 죽이는 능력을 기반으로합니다. 이 방법은 세포 독성 연구뿐만 아니라 합성, 반합성 및 천연 제품의 일반적인 독성 스크리닝을위한 편리한 출발점을 나타냅니다. 일반적으로 전술한 목적에 적합한 다른 많은 분석(시험관 내 세포 또는 효모 균주, 제브라피쉬, 설치류)과 비교하여 간단하고 빠르며 저렴한 분석으로 간주될 수 있습니다. 또한 특별한 교육 없이도 쉽게 수행 할 수 있습니다. 전반적으로, A. salina 분석은 선택된 화합물의 예비 독성 평가 및 천연 제품 추출물의 바이오 유도 분획화에 유용한 도구를 나타낸다.
Introduction
식물, 동물 또는 미생물의 천연물은 다양한 생물학적 및 약리학적 활성으로 인해 새로운생리 활성 분자의 개발에서 수년 동안 관심이 증가하고 있습니다1. 그러나 관련 부작용, 약물 내성 또는 약제의 부적절한 특이성은 특히 항암제로 사용될 때 비효율적인 치료 1,2로 이어질 수 있는 주요 요인을 나타냅니다.
지난 수십 년 동안 여러 식물 유래 세포 독성 제제가 발견되었으며 그 중 일부는 항암제 1,2,3으로 사용되었습니다. 이러한 맥락에서 파클리탁셀은 천연 기원의 가장 잘 알려져 있고 가장 활동적인 화학 요법 약물 중 하나로보고됩니다 3,4. 현재 시장에 나와있는 모든 의약품의 35 % 이상이 천연 제품에서 파생되거나 천연 제품에서 영감을 얻은 것으로 추정됩니다5. 이러한 화합물의 잠재적 인 높은 독성은 다양한 유형의 오염 물질 또는 식물 자체의 대사 성분이 독성 영향을 일으킬 수 있기 때문에 모든 연구 단계에서 고려해야합니다. 이러한 이유로 새로운 잠재적 식물 기반 치료의 생물학적 활성과 안전성을 평가하기 위해 예비 단계에서 약리학 적 및 독성 학적 프로파일을 수행해야합니다. 새로운 생리 활성 샘플의 독성을 평가하기 위해 무척추 동물을 연구하기에 가장 좋은 모델로 간주 할 수 있습니다. 그들은 최소한의 윤리적 요구 사항을 요구하고 예비 체외 분석을 허용하여 척추 동물 1,6의 다음 테스트 라운드에서 가장 유망한 제품의 우선 순위를 지정합니다.
일반적으로 소금물 새우로 알려진 A. salina는 Artemia 속에 속하는 작은 호 염성 무척추 동물입니다 (가족 Artemiidae, 주문 Anostraca, 아문 갑각류; 그림 1). 해양 및 수생 식염수 생태계에서 소금물 새우는 미세 조류를 먹고 물고기에게 먹이를주는 데 사용되는 동물성 플랑크톤의 구성 요소이기 때문에 중요한 영양 역할을합니다. 또한, 그들의 유충 (nauplii로 알려짐)은 예비 연구 1,3,7 동안 일반적인 독성 평가에 널리 사용됩니다.
Artemia spp.는 치사율 연구에 널리 사용되며 실험실 1,8에서 자란 nauplii를 죽이는 능력을 기반으로 잠재적으로 생리 활성 화합물의 독성을 추적하여 독성 평가를위한 편리한 출발점이기도합니다. 이러한 이유로 A. salina의 사용은 동물 모델9에 대한 다른 테스트에 비해 매우 효율적이고 사용하기 쉬운 방법이기 때문에 일반적인 독성 연구에서 매력을 얻었습니다.
간단한 해부학, 작은 크기 및 짧은 수명주기로 인해 한 번의 실험으로 수많은 무척추 동물을 연구 할 수 있습니다. 따라서 유전적 순응성과 저비용 호환성을 대규모 스크리닝과결합합니다1. 이러한 맥락에서 일반적인 독성 분석에서 염수 새우를 사용하면 빠른 성장 (부화에서 첫 번째 결과까지 28-72 시간 필요), 비용 효율성 및 상업용 계란의 긴 유통 기한과 같은 몇 가지 이점이 있습니다., 일년 내내 사용할 수있는 3,10. 반면에 무척추 동물은 원시 장기 시스템을 가지고 있고 적응 면역 체계가 없기 때문에 인간 세포에 대한 완벽하고 신뢰할 수있는 모델을 나타내지 않습니다1.
그러나, 선택된 샘플의 일반적인 독성에 대한 예비 평가 방법을 제공한다. 치사율 분석으로 널리 사용되기 때문에 잠재적인 항암제의 독성 효과에 대한 잠정적 징후를 제공할 수 있습니다. 또한 Artemia 새우 중에서 가능한 가장 낮은 사망률을 나타내는 것이 필수적인 다른 생물학적 활동이 부여 된 화합물의 일반적인 독성에 대한 피드백을 얻는 데에도 종종 사용됩니다.
우리 그룹의 진행중인 연구에서 Plectranthus 종의 다른 추출물은 항산화 및 항균 활성을 보여주었습니다 (미공개 결과). 병행하여, 분리 된 화합물을 추출물의 정제에 의해 수득 한 다음, 화학적으로 변형 하였다. 추출물, 순수 화합물 및 반합성 유도체를 일반적인 독성 측면에서 테스트했습니다. 이러한 맥락에서, 본 연구는 Plectranthus11 속의 다른 식물에서 생리 활성 추출물 및 분리 된 화합물의 일반적인 독성 및 잠재적 세포 독성 활성의 평가를위한 Artemia 치사 생물학적 분석법의 사용에 대한 개요를 제공하는 것을 목표로합니다.
그림 1: 현미경으로 본 아르테미아 살리나 . 현미경으로 본 A. salina 의 새로 부화 된 nauplii (배율 12x). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Protocol
Representative Results
Discussion
지난 몇 년 동안 과학계는 독성 스크리닝을위한 대체 모델에 대한 관심을 증가 시켰습니다21. A. salina 치사성 생물학적 분석 외에도 샘플 내약성 평가를 위해 다른 방법론이 일반적으로 수행되며 척추 동물 생물 분석 (예 : 설치류), 무척추 동물 (예 : 제브라 피쉬), 효모 균주 또는 세포를 사용하는 시험관 내 방법 및 인실리코 방법22,23,24,25…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
아밀카르 로베르토 교수를 추모합니다.
이 작업은 CBIOS 및 박사 보조금 SFRH/BD/137671/2018(Vera Isca)에 기인하는 UIDB/04567/2020 및 UIDP/04567/2020 프로젝트에 따라 Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT, 포르투갈)에 의해 재정적으로 지원되었습니다.
Materials
| 24-well plates | Thermo Fisher Scientific, Denmark | 174899 | Thermo Scientific Nunc Up Cell 24 multidish |
| Aluminium foil | Albal | – | Can be purchased in supermarket |
| Artemio Set | JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany | 61066000 | Can be purchased in pet shops |
| Binocular microscope | Ceti, Belgium | 1700.0000 | Flexum-24AED, 220-240 V, 50 Hz |
| Bottles | – | – | 0.5 L Diameter: 5.8 cm; Height: 12 cm |
| Brine shrimp cysts | JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany | 3090700 | Can be purchased in pet shops |
| Brine shrimp salt | JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany | 3090600 | Can be purchased in pet shops |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | VWR chemicals | CAS: 67-68-5 | 99% purity |
| Discartable tips | Diamond | F171500 | Volume range: 100 – 1000 µL |
| Eppendorf microtubes | BRAND | 7,80,546 | Microtubes, PP, 2 mL, BIO-CERT PCR QUALITY |
| Erlenmeyer flask | VWR chemicals | 4,47,109 | volume: 100 mL |
| Glass beaker | Normax | 3.2111654N | Volume: 1000 mL |
| Gloves | Guantes Luna | GLSP3 | – |
| GraphPad Prism | GraphPad Software, San Diego, CA, USA | – | GraphPad Prism version 5.00 for Windows, www.graphpad.com, accessed on 5 February 2021; commercial statistical analysis software |
| Home-made A. salina Grower | - | - | Home made: two plastic bottles connected by a hose |
| Hot glue | Parkside | PHP500E3 | 230 V, 50 Hz, 25 W |
| Incubator | Heidolph Instruments, Denmark | - | One Heidolph Unimax 1010 equipment and one Heidolph Inkubator 1006 |
| Light | Roblan | SKYC3008FE14 | LED light bulb |
| Micropipettes | VWR chemicals | 613-5265 | Volume range: 100 – 1000 µL |
| Potassium dichromate (K2Cr2O7) | VWR chemicals | CAS: 7778-50-9 | 99% purity |
| Pump ProAir a50 | JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany | - | Included in the Artemio Set+1 kit |
| Rubber tube | – | – | 1.3 cm outer and 0.9 cm inner diameter |
| Stirring rod | VWR chemicals | 441-0147 |  6 mm, 250 mm |
| Termometer | VWR chemicals | 620-0821 | 0 – 100 °C |
Riferimenti
- Ntungwe, N. E., et al. Artemia species: An important tool to screen general toxicity samples. Current Pharmaceutical Design. 26 (24), 2892-2908 (2020).
- Cragg, G. M., Newman, D. J. Natural products: A continuing source of novel drug leads. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – General Subjects. 1830 (6), 3670-3695 (2013).
- Ntungwe, E., et al. General toxicity screening of Royleanone derivatives using an artemia salina model. Journal Biomedical and Biopharmaceutical Research. 18 (1), 114 (2021).
- Seca, A., Plant Pinto, D. secondary metabolites as anticancer agents: Successes in clinical trials and therapeutic application. International Journal of Molecular Sciences. 19 (1), 263 (2018).
- Calixto, J. B. The role of natural products in modern drug discovery. Anais da Academia Brasileira de Ciências. 91 (3), 1-7 (2019).
- Mandrell, D., et al. Automated zebrafish chorion removal and single embryo placement: optimizing throughput of zebrafish developmental toxicity screens. Journal of Laboratory Automation. 17 (1), 66-74 (2012).
- Zhang, Y., Mu, J., Han, J., Gu, X. An improved brine shrimp larvae lethality microwell test method. Toxicology Mechanisms and Methods. 22 (1), 23-30 (2012).
- Domínguez-Villegas, V., et al. antioxidant and cytotoxicity activities of methanolic extract and prenylated flavanones isolated from leaves of eysehardtia platycarpa. Natural Product Communications. 8 (2), 177-180 (2013).
- Hamidi, M. R., Jovanova, B., Panovska, T. K. Toxicological evaluation of the plant products using Brine Shrimp (Artemia salina L.) model. Macedonian Pharmaceutical Bulletin. 60 (01), 9-18 (2014).
- Libralato, G., Prato, E., Migliore, L., Cicero, A. M., Manfra, L. A review of toxicity testing protocols and endpoints with Artemia spp. Ecological Indicators. 69, 35-49 (2016).
- Mendes Hacke, A. C., et al. Cytotoxicity of cymbopogon citratus (DC) Stapf fractions, essential oil, citral, and geraniol in human leukocytes and erythrocytes. Journal of Ethnopharmacology. 291, 115147 (2022).
- Thangapandi, V., Pushpanathan, T. Comparison of the Artemia salina and Artemia fransiscana bioassays for toxicity of Indian medicinal plants. Journal of Coastal Life Medicine. 2 (6), 453-457 (2014).
- Syahmi, A. R. M., et al. Acute oral toxicity and brine shrimp lethality of Elaeis guineensis Jacq., (Oil Palm Leaf) methanol extract. Molecules. 15 (11), 8111-8121 (2010).
- Sasidharan, S., et al. Acute toxicity impacts of Euphorbia hirta L extract on behavior, organs body weight index and histopathology of organs of the mice and Artemia salina. Pharmacognosy Research. 4 (3), 170 (2012).
- Libralato, G. The case of Artemia spp. in nanoecotoxicology. Marine Environmental Research. 101, 38-43 (2014).
- Okumu, M. O., et al. Artemia salina as an animal model for the preliminary evaluation of snake venom-induced toxicity. Toxicon: X. 12, 100082 (2021).
- Rajabi, S., Ramazani, A., Hamidi, M., Naji, T. Artemia salina as a model organism in toxicity assessment of nanoparticles. DARU Journal of Pharmaceutical Sciences. 23 (1), 20 (2015).
- Svensson, B. -. M., Mathiasson, L., Mårtensson, L., Bergström, S. Artemia salina as test organism for assessment of acute toxicity of leachate water from landfills. Environmental Monitoring and Assessment. 102 (1), 309-321 (2005).
- Banti, C., Hadjikakou, S. Evaluation of toxicity with brine shrimp assay. Bio-Protocol. 11 (2), 3895 (2021).
- Pecoraro, R., et al. Artemia salina: A microcrustacean to assess engineered nanoparticles toxicity. Microscopy Research and Technique. 84 (3), 531-536 (2021).
- Lillicrap, A., et al. Alternative approaches to vertebrate ecotoxicity tests in the 21st century: A review of developments over the last 2 decades and current status. Environmental Toxicology and Chemistry. 35 (11), 2637-2646 (2016).
- Ribeiro, I. C., et al. Yeasts as a model for assessing the toxicity of the fungicides Penconazol, Cymoxanil and Dichlofulanid. Chemosphere. (10), 1637-1642 (2000).
- Armour, C. D., Lum, P. Y. From drug to protein: using yeast genetics for high-throughput target discovery. Current Opinion in Chemical Biology. 9 (1), 20-24 (2005).
- Modarresi Chahardehi, A., Arsad, H., Lim, V. Zebrafish as a successful animal model for screening toxicity of medicinal plants. Plants. 9 (10), 1345 (2020).
- Fischer, I., Milton, C., Wallace, H. Toxicity testing is evolving. Toxicology Research. 9 (2), 67-80 (2020).
- de Araújo, G. L., et al. Alternative methods in toxicity testing: the current approach. Brazilian Journal of Pharmaceutical Sciences. 50 (1), 55-62 (2014).
- Toussaint, M., et al. A high-throughput method to measure the sensitivity of yeast cells to genotoxic agents in liquid cultures. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 606 (1), 92-105 (2006).
- Horzmann, K. A., Freeman, J. L. Making waves: New developments in toxicology with the zebrafish. Toxicological Sciences. 163 (1), 5-12 (2018).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: An introduction. Journal of Visualized Experiments. (69), e4196 (2012).
- Cunliffe, V. T., Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. . Zebrafish: A Practical Approach. , (2002).
- Sitarek, P., et al. Insight the biological activities of selected Abietane Diterpenes isolated from Plectranthus spp. Biomolecules. 10 (2), 194 (2020).
- Matias, D., et al. Cytotoxic activity of Royleanone Diterpenes from Plectranthus madagascariensis Benth. ACS Omega. 4 (5), 8094-8103 (2019).
- Garcia, C., et al. Royleanone derivatives from Plectranthus spp. as a novel class of P-glycoprotein inhibitors. Frontiers in Pharmacology. 11, (2020).
