מידול התפתחות המוח הקטן האנושי במבחנה במבנה דו-ממדי
Summary
הפרוטוקול הנוכחי מסביר את יצירתו של מונולאייר דו-ממדי של תאי המוח הקטן מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים לחקר השלבים המוקדמים של התפתחות המוח הקטן.
Abstract
ההתפתחות המדויקת והמתוזמנת של המוח הקטן חיונית לא רק לתיאום ואיזון מוטורי מדויקים אלא גם לקוגניציה. בנוסף, הפרעה בהתפתחות המוח הקטן מעורבת בהפרעות נוירו-התפתחותיות רבות, כולל אוטיזם, הפרעת קשב וריכוז (ADHD) וסכיזופרניה. חקירות של התפתחות המוח הקטן בבני אדם התאפשרו בעבר רק באמצעות מחקרים שלאחר המוות או הדמיה מוחית, אך שיטות אלה אינן מספיקות להבנת השינויים המולקולריים והתאיים המתרחשים ב- vivo במהלך ההתפתחות המוקדמת, כאשר נוצרות הפרעות נוירו-התפתחותיות רבות. הופעתן של טכניקות ליצירת תאי גזע פלוריפוטנטיים (iPSCs) הנגרמים על ידי בני אדם מתאים סומטיים והיכולת להתמיין מחדש עוד יותר תאי גזע פלוריפוטנטיים לנוירונים סללו את הדרך למודלים חוץ-גופיים של התפתחות מוחית מוקדמת. המחקר הנוכחי מספק צעדים פשוטים לקראת יצירת תאים cerebellar עבור יישומים הדורשים מבנה חד-שכבתי דו-ממדי (2D). תאי Cerebellar המייצגים שלבי התפתחות מוקדמים נגזרים מתאי גזע פלוריפוטנטיים (iPSCs) אנושיים באמצעות השלבים הבאים: ראשית, גופים עובריים מיוצרים בתרבית תלת-ממדית (3D), לאחר מכן הם מטופלים ב-FGF2 ובאינסולין כדי לקדם את מפרט הגורל של המוח הקטן, ולבסוף, הם מובחנים באופן סופי כמונו-שכבה על מצעים מצופים פולי-l-אורניתין (אש”ף)/למינין. לאחר 35 ימים של התמיינות, תרביות תאים צרבלריים שמקורם ב-iPSC מבטאות סמנים של המוח הקטן, כולל ATOH1, PTF1α, PAX6 ו-KIRREL2, מה שמרמז על כך שפרוטוקול זה יוצר מבשרי תאי צרבלר גלוטמטרגיים ו-GABAergic cerebellar, כמו גם אבות של תאי Purkinje. יתר על כן, התאים הממוינים מראים מורפולוגיה עצבית מובהקת והם חיוביים לסמנים אימונופלואורסצנטיים של זהות עצבית כגון TUBB3. תאים אלה מבטאים מולקולות הנחיה אקסונאליות, כולל סמפורין-4C, פלקסין-B2 ונוירופילין-1, ויכולים לשמש מודל לחקר המנגנונים המולקולריים של צמיחת נויריט וקישוריות סינפטית. שיטה זו יוצרת נוירונים במוח הקטן האנושי שימושיים עבור יישומים במורד הזרם, כולל ביטוי גנים, מחקרים פיזיולוגיים ומורפולוגיים הדורשים פורמטים חד-שכבתיים דו-ממדיים.
Introduction
הבנת התפתחות המוח הקטן האנושי וחלונות הזמן הקריטיים של תהליך זה חשובה לא רק לפענוח הגורמים האפשריים להפרעות נוירו-התפתחותיות, אלא גם לזיהוי מטרות חדשות להתערבות טיפולית. מידול התפתחות המוח הקטן האנושי במבחנה היה מאתגר, אך עם הזמן, פרוטוקולים רבים המבדילים בין תאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) או iPSCs עם גורלות שושלת המוח הקטן התגלו 1,2,3,4,5,6,7,8 . יתר על כן, חשוב לפתח פרוטוקולים המניבים תוצאות הניתנות לשחזור, הם פשוטים יחסית (כדי להפחית טעויות), ואינם כבדים בעלויות כספיות.
הפרוטוקולים הראשונים להתמיינות המוח הקטן נוצרו מתרביות דו-ממדיות מגופים עובריים מצופים (EBs), מה שגרם לגורל המוח הקטן עם גורמי גדילה שונים הדומים להתפתחות in vivo, כולל WNT, BMPs ו-FGFs 1,9. פרוטוקולים שפורסמו לאחרונה גרמו להבחנה בעיקר בתרבית אורגנואידית תלת-ממדית עם FGF2 ואינסולין, ולאחר מכן FGF19 ו-SDF1 עבור מבנים דמויי שפתיים רומביים3,4, או השתמשו בשילוב של FGF2, FGF4 ו-FGF85. שתי שיטות האינדוקציה האורגנואידית של המוח הקטן הביאו לאורגנואידים תלת-ממדיים דומים של המוח הקטן, שכן שני הפרוטוקולים דיווחו על ביטוי דומה של סמן המוח הקטן בנקודות זמן זהות. הולמס והיינה הרחיבו את פרוטוקול 5 התלת-ממדישלהם כדי להראות שתאי המוח הקטן הדו-ממדיים יכולים להיווצר מתאי גזע עובריים ו-iPSCs, שמתחילים כאגרגטים תלת-ממדיים. בנוסף, Silva et al.7 הראו כי תאים המייצגים נוירונים בוגרים במוח הקטן בדו-ממד יכולים להיווצר בגישה דומה להולמס והיינה, תוך שימוש בנקודת זמן שונה למעבר מתלת-ממד לדו-ממד ולהארכת זמן הגדילה וההתבגרות.
הפרוטוקול הנוכחי גורם לגורל המוח הקטן ב-iPSCs נטולי הזנה על ידי יצירת גופים עובריים צפים חופשיים (EBs) באמצעות אינסולין ו-FGF2 ולאחר מכן ציפוי ה-EBs על כלים מצופים אש”ף/למינין ביום ה-14 לגדילה והתמיינות דו-ממדית. עד יום 35, תאים עם זהות cerebellar מתקבלים. היכולת לשחזר את השלבים המוקדמים של התפתחות המוח הקטן, במיוחד בסביבה דו-ממדית, מאפשרת לחוקרים לענות על שאלות ספציפיות הדורשות ניסויים עם מבנה חד-שכבתי. פרוטוקול זה מקובל גם על שינויים נוספים כגון משטחים מיקרו-מפוסלים, מבחני צמיחה אקסונאליים ומיון תאים כדי להעשיר את אוכלוסיות התאים הרצויות.
Protocol
Representative Results
Discussion
היכולת למדל את התפתחות המוח הקטן האנושי במבחנה חשובה למידול מחלות, כמו גם לקידום ההבנה של התפתחות מוחית תקינה. פרוטוקולים פחות מסובכים וחסכוניים יוצרים יותר הזדמנויות ליצירת נתונים הניתנים לשכפול וליישום נרחב במעבדות מדעיות מרובות. פרוטוקול הבחנה של המוח הקטן מתואר כאן באמצעות שיט?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לג’ני גרינגר ריצ’רדס על עבודתה היסודית באימות נושאי הבקרה שלנו, שמהם יצרנו את ה- iPSCs של הבקרה. עבודה זו נתמכה על ידי NIH T32 MH019113 (ל- D.A.M. ו- K.A.K.), קרן נלי בול (ל- T.H.W. ו- A.J.W.), NIH R01 MH111578 (ל- V.A.M. ו- J.A.W.), NIH KL2 TR002536 (ל- A.J.W.), וקרן הצדקה רוי ג’יי קארבר (ל- V.A.M., J.A.W. ו- A.J.W.). הדמויות נוצרו עם BioRender.com.
Materials
| 10 mL Serological pipette | Fisher Scientific | 13-678-26D | |
| 1-thio-glycerol | Sigma | M6145 | |
| 2 mL Serological pipette | Fisher Scientific | 13-678-26B | |
| 250 mL Filter Unit, 0.2 µm aPES, 50 mm Dia | Fisher Scientific | FB12566502 | |
| 35 mm Easy Grip Tissue Cluture Dish | Falcon | 353001 | |
| 4D Nucleofector core unit | Lonza | 276885 | Nucleofector |
| 5 mL Serological pipette | Fisher Scientific | 13-678-25D | |
| 60 mm Easy Grip Tissue Culture Dish | Falcon | 353004 | |
| 6-well ultra-low attachment plates | Corning | 3471 | |
| 9" Disposable Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
| Apo-transferrin | Sigma | T1147 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A9418 | |
| Cell culture grade water | Cytiva | SH30529.02 | |
| Chemically defined lipid concentrate | Gibco | 11905031 | |
| Chroman 1 | Cayman | 34681 | |
| Class II, Type A2, Biological safety Cabinet | NuAire, Inc. | NU-540-600 | Hood, UV light |
| Costar 24-well plate, TC treated | Corning | 3526 | |
| Costar 6-well plate, TC treated | Corning | 3516 | |
| DAPI solution | Thermo Scientific | 62248 | |
| DMEM | Gibco | 11965092 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| DMSO (Dimethly sulfoxide) | Sigma | D2438 | |
| DPBS+/+ | Gibco | 14040133 | |
| Emricasan | Cayman | 22204 | |
| Epi5 episomal iPSC reprogramming kit | Life Technologies | A15960 | |
| Essential 8-Flex | Gibco | A2858501 | PSC medium with heat-stable FGF2 |
| EVOS XL Core Imaging system | Life Technologies | AMEX1000 | |
| Fetal bovine serum – Premium Select | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| FGF2 | Peprotech | 100-18B | |
| GlutaMAX supplement | Gibco | 35050061 | L-alanine-L-glutamine supplement |
| Ham's F12 Nutrient Mix | Gibco | 11765054 | |
| HERAcell VIOS 160i CO2 incubator | Thermo Scientific | 50144906 | |
| Human Anti-EN2, mouse | Santa Cruz Biotechnology | sc-293311 | |
| Human anti-Ki67/MKI67, rabbit | R&D Systems | MAB7617 | |
| Human anti-PTF1a, rabbit | Novus Biologicals | NBP2-98726 | |
| Human anti-TUBB3, mouse | Biolegend | 801213 | |
| IMDM | Gibco | 12440053 | |
| Insulin | Gibco | 12585 | |
| Laminin Mouse Protein | Gibco | 23017015 | |
| Matrigel Matrix | Corning | 354234 | Basement membrane matrix |
| MEM-NEAA | Gibco | 11140050 | |
| Mini Centrifuge | Labnet International | C1310 | Benchtop mini centrifuge |
| Monarch RNA Cleanup Kit (50 µg) | New England BioLabs | T2040 | Silica spin columns |
| Monarch Total RNA Miniprep Kit | New England BioLabs | T2010 | Silica spin columns |
| N-2 supplement | Gibco | 17502-048 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010023 | |
| PFA 16% | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Polyamine supplement | Sigma | P8483 | |
| Poly-L-Ornithine (PLO) | Sigma | 3655 | |
| Potassium chloride | Sigma | 746436 | |
| SB431542 | Sigma | 54317 | |
| See through self-sealable pouches | Steriking | SS-T2 (90×250) | Autoclave pouches |
| Sodium citrate dihydrate | Fisher Scientific | S279-500 | |
| Syringe filters, sterile, PES 0.22 µm, 30 mm Dia | Research Products International | 256131 | |
| Trans-ISRIB | Cayman | 16258 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596018 | Phenol and guanidine isothiocyanate |
| TrypLE Express Enzyme (1x) | Gibco | 12604039 | Cell dissociation reagent |
| Vapor pressure osmometer | Wescor, Inc. | Model 5520 | Osmometer |
| Y-27632 | Biogems | 1293823 |
Riferimenti
- Erceg, S., Lukovic, D., Moreno-Manzano, V., Stojkovic, M., Bhattacharya, S. S. Derivation of cerebellar neurons from human pluripotent stem cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. , (2012).
- Erceg, S., et al. Efficient differentiation of human embryonic stem cells into functional cerebellar-like cells. Stem Cells and Development. 19 (11), 1745-1756 (2010).
- Muguruma, K. 3D culture for self-formation of the cerebellum from human pluripotent stem cells through induction of the isthmic organizer. Methods in Molecular Biology. 1597, 31-41 (2017).
- Muguruma, K., Nishiyama, A., Kawakami, H., Hashimoto, K., Sasai, Y. Self-organization of polarized cerebellar tissue in 3D culture of human pluripotent stem cells. Cell Reports. 10 (4), 537-550 (2015).
- Holmes, D. B., Heine, V. M. Streamlined 3D cerebellar differentiation protocol with optional 2D modification. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (130), e56888 (2017).
- Holmes, D. B., Heine, V. M. Simplified 3D protocol capable of generating early cortical neuroepithelium. Biology Open. 6 (3), 402-406 (2017).
- Silva, T. P., et al. Maturation of human pluripotent stem cell-derived cerebellar neurons in the absence of co-culture. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 70 (2020).
- Nayler, S., Agarwal, D., Curion, F., Bowden, R., Becker, E. B. E. High-resolution transcriptional landscape of xeno-free human induced pluripotent stem cell-derived cerebellar organoids. Scientific Reports. 11, 12959 (2021).
- Salero, E., Hatten, M. E. Differentiation of ES cells into cerebellar neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (8), 2997-3002 (2007).
- Nie, Y., Walsh, P., Clarke, D. L., Rowley, J. A., Fellner, T. Scalable passaging of adherent human pluripotent stem cells. PLoS One. 9 (1), 88012 (2014).
- Chen, Y., et al. A versatile polypharmacology platform promotes cytoprotection and viability of human pluripotent and differentiated cells. Nature Methods. 18 (5), 528-541 (2021).
- Machold, R., Fishell, G. Math1 is expressed in temporally discrete pools of cerebellar rhombic-lip neural progenitors. Neuron. 48 (1), 17-24 (2005).
- Wang, V. Y., Rose, M. F., Zoghbi, H. Y. Math1 expression redefines the rhombic lip derivatives and reveals novel lineages within the brainstem and cerebellum. Neuron. 48 (1), 31-43 (2005).
- Hoshino, M., et al. Ptf1a, a bHLH transcriptional gene, defines GABAergic neuronal fates in cerebellum. Neuron. 47 (2), 201-213 (2005).
- Mizuhara, E., et al. Purkinje cells originate from cerebellar ventricular zone progenitors positive for Neph3 and E-cadherin. Biologia dello sviluppo. 338 (2), 202-214 (2010).
- Ferreira, A., Caceres, A. Expression of the Class III β-tubulin isotype in developing neurons in culture. Journal of Neuroscience Research. 32 (4), 516-529 (1992).
- Sullivan, K. F., Cleveland, D. W. Identification of conserved isotype-defining variable region sequences for four vertebrate beta tubulin polypeptide classes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83 (12), 4327-4331 (1986).
- Joyner, A. L. Engrailed, Wnt and Pax genes regulate midbrain-hindbrain development. Trends in Genetics. 12 (1), 15-20 (1996).
- Joyner, A. L., Liu, A., Millet, S. Otx2, Gbx2 and Fgf8 interact to position and maintain a mid-hindbrain organizer. Current Opinion in Cell Biology. 12 (6), 736-741 (2000).
- Minaki, Y., Nakatani, T., Mizuhara, E., Inoue, T., Ono, Y. Identification of a novel transcriptional corepressor, Corl2, as a cerebellar Purkinje cell-selective marker. Gene Expression Patterns. 8 (6), 418-423 (2008).
- Aldinger, K. A., et al. Spatial and cell type transcriptional landscape of human cerebellar development. Nature Neuroscience. 24 (8), 1163-1175 (2021).
- Fossat, N., Courtois, V., Chatelain, G., Brun, G., Lamonerie, T. Alternative usage of Otx2 promoters during mouse development. Developmental Dynamics. 233 (1), 154-160 (2005).
- Akbarian, S., et al. The PsychENCODE project. Nature Neuroscience. 18 (12), 1707-1712 (2015).
- Aijaz, S., et al. Expression analysis of SIX3 and SIX6 in human tissues reveals differences in expression and a novel correlation between the expression of SIX3 and the genes encoding isocitrate dehyhrogenase and cadherin 18. Genomics. 86 (1), 86-99 (2005).
- Conte, I., Morcillo, J., Bovolenta, P. Comparative analysis of Six3 and Six6 distribution in the developing and adult mouse brain. Developmental Dynamics. 234 (3), 718-725 (2005).
- Andreasen, N. C., Pierson, R. The role of the cerebellum in schizophrenia. Biological Psychiatry. 64 (2), 81-88 (2008).
- Nopoulos, P. C., Ceilley, J. W., Gailis, E. A., Andreasen, N. C. An MRI study of cerebellar vermis morphology in patients with schizophrenia: Evidence in support of the cognitive dysmetria concept. Biological Psychiatry. 46 (5), 703-711 (1999).
- Jacobsen, L. K., et al. Quantitative morphology of the cerebellum and fourth ventricle in childhood-onset schizophrenia. American Journal of Psychiatry. 154 (12), 1663-1669 (1997).
- Saywell, V., Cioni, J. -. M., Ango, F. Developmental gene expression profile of axon guidance cues in Purkinje cells during cerebellar circuit formation. The Cerebellum. 13 (3), 307-317 (2014).
- Kim, D., Ackerman, S. L. The UNC5C netrin receptor regulates dorsal guidance of mouse hindbrain axons. Journal of Neuroscience. 31 (6), 2167-2179 (2011).
- Maier, V., et al. Semaphorin 4C and 4G are ligands of Plexin-B2 required in cerebellar development. Molecular and Cellular Neuroscience. 46 (2), 419-431 (2011).
- Telley, L., et al. Dual function of NRP1 in axon guidance and subcellular target recognition in cerebellum. Neuron. 91 (6), 1276-1291 (2016).
- Wang, S., et al. Differentiation of human induced pluripotent stem cells to mature functional Purkinje neurons. Scientific Reports. 5, 9232 (2015).
- Shabanipour, S., et al. Primary culture of neurons isolated from embryonic mouse cerebellum. Journal of Visualized Experiments. (152), e60168 (2019).
