トマトの種子発育の研究のための効率的な清算プロトコル(Solanum lycopersicum L.)

トマト(S. lycopersicum L.)は、世界で最も重要な野菜作物の1つであり、2020年には510万ヘクタールから1億8,680万トンの肉質の果物が生産されています¹。ナス、ピーマン、ジャガイモ、タバコなどの多くの商業的に重要な作物を含む、約2,716種²の大きなナス科に属しています。栽培トマトは二倍体種(2n = 2x = 24)で、ゲノムサイズは約900 Mb³です。長い間、野生のナス属から望ましい形質を選択することにより、トマトの家畜化と育種に多大な努力が払われてきました。トマト遺伝学リソースセンターには5,000を超えるトマトのアクセッションがリストされており、世界中で80,000を超えるトマトの生殖質が保管されています⁴。トマト植物は温室内で多年生であり、種子によって繁殖します。成熟したトマト種子は、完全に成長した胚、残留細胞型胚乳、および硬い種皮の3つの主要な区画で構成されています^5,6(図1A)。二重受精後、細胞型胚乳の発生は接合子の発生に先行する。開花後~5~6日(DAF)に、胚乳が6〜8個の核⁷からなるときに2細胞前胚が最初に観察される。Solanum pimpinellifoliumでは、胚は20 DAF後に最終サイズに近づき、種子は32 DAF⁸の後に発芽するために生存可能です。胚が成長するにつれて、胚乳は徐々に吸収され、少量の胚乳だけが種子に残ります。残留胚乳は、幼根先端を囲む小毛洞胚乳と^{、種子の残りの部分}の外側胚乳^9,10からなる。外側の種皮は、外皮の肥厚して木化した外側表皮から発達し、外皮の残骸の死んだ層とともに、胚と胚乳を保護するために硬い殻を形成します⁵。

図1:ソラナム・リコペルシカムとシロイヌナズナの成熟種子の模式図。 (A)成熟トマト種子の縦断的解剖学的構造。(B)成熟したシロイヌナズナ種子の縦断的解剖学的構造。成熟したトマトの種子は、シロイヌナズナの種子の約70倍の大きさです。スケールバー = (A) 400 μm、(B) 100 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

高品質のトマト種子の生産は、胚、胚乳、および母体の種子成分間の調整に依存します¹¹。種子発生における重要な遺伝子とネットワークを解剖するには、変異種子の深くフルトラックの表現型記録が必要です。半薄切片やパラフィン切片などの従来の包埋切片技術は、胚の局所的で微細な構造を観察するためにトマト種子に広く適用されています¹²、^13、14、15。ただし、薄い切片からシードの発達を分析することは通常面倒であり、z軸の空間分解能が不足しています。それに比べて、組織クリアリングは、発生する可能性が最も高い胚の欠陥の発生段階を特定するための迅速かつ効率的な方法です¹⁶。透明化方法は、1つ以上の生化学物質¹⁶で屈折率を均質化することによって内部組織の不透明さを低減する。全組織クリアリングは、その完全性を損なうことなく植物組織構造の観察を可能にし、クリアリング技術と3次元イメージングの組み合わせは、植物器官の形態および発生状態に関する情報を得るための理想的なソリューションとなっている^17,18。長年にわたり、種子除去技術は、シロイヌナズナ、尋常性ホルデウム、および尋常性ベータ19,20,21,22,23を含む様々な植物種で使用されてきた。これらのうち、ホールマウント胚珠除去技術は、サイズが小さく、種皮細胞の4〜5層、および核型胚乳^24,25のために、シロイヌナズナの種子発達を研究するための効率的なアプローチでした。Hoyerの溶液²⁶の出現など、さまざまな透明混合物の継続的な更新により、大麦胚珠の内部構造は、その胚乳が種子の大部分を占めているにもかかわらず、高度な明瞭さで画像化されました。テンサイの胚形成は、減圧処理と塩酸¹⁹を組み合わせた透明化によって観察できます。それにもかかわらず、上記の種とは異なり、トマト種子のプロトコルをクリアすることによる発生学的観察は報告されていません。これにより、トマトの胚発生と種子発生の詳細な調査が妨げられます。

抱水クロラールは、浸漬された組織および細胞を異なる光学面上に表示させることを可能にし、細胞または組織成分を実質的に保存する透明化溶液として一般的に使用される^27、28、29。抱水クロラールベースのクリアリングプロトコルは、シロイヌナズナの胚と胚乳を観察するための種子のホールマウントクリアリングに使用されています^21,28。しかし、この清澄化液は、シロイヌナズナの種子よりも不浸透性であるトマトの種子の除去には効率的ではありません。物理的障壁には、(1)トマトの外皮は3〜15 DAF 30,31で約20の細胞層を有する、(2)トマトの胚乳は核型ではなく細胞型^である32、(3)トマト種子のサイズは約70倍大きい^33,34、(4)大量の種皮粘液を生成し、透明化試薬の浸透をブロックし、胚細胞の可視化に影響を与える。

そこで本報告では、トマト種子をさまざまな段階で全マウントで除去するための最適化された抱水クロラールベースの透明化方法を提示し、胚発生過程の深部イメージングを可能にします(図2)。