Ablação a Laser Multifóton de Centros Organizadores de Microtúbulos Citoplasmáticos em Oócitos de Camundongos

Todos os métodos aqui descritos foram aprovados pela Universidade do Missouri (Animal Care Quality Assurance Ref. Number 9695). Camundongos repórteres Cep192-eGFP fêmeas com idades entre 6-8 semanas de idade foram utilizados no presente estudo. Para gerar camundongos repórteres Cep192-eGFP , o reparo dirigido por homologia mediado por CRISPR/Cas9 foi usado para integrar o gene repórter EGFP no genoma do camundongo CF-1. O repórter do EGFP foi fundido no terminal C do Cep192 (componente integrante dos MTOCs)15. Para manter a colônia de camundongos, foram utilizados camundongos repórteres homozigotos Cep192-eGfp . Todos os animais foram mantidos em gaiolas (até quatro animais/gaiola) a 21 °C e 55% de umidade, com ciclo claro/escuro de 12 h e acesso ad libitum a alimentos e água. 1. Coleção de ovócitos do rato Preparar o meio de cultura (Chatot, Ziomek e Bavister, CZB19, ver Tabela de Materiais) e incubá-lo a 37 °C e 5% de CO2 durante a noite.NOTA: O meio CZB pode ser armazenado a 4 °C durante 1 mês (consulte o arquivo suplementar 1 para a composição da mídia). Complementar o meio CZB com glutamina (1 mM) e milrinona (2,5 mM) (CZB + M) (ver Tabela de Materiais) e colocá-lo na incubadora.NOTA: A milrinona é um inibidor da fosfodiesterase que mantém os ovócitos presos na prófase I e impede a retomada meiótica20. Prepare o meio de coleta (meio essencial mínimo livre de bicarbonato, MEM) contendo 3 mg/mL de polivinilpirolidona (PVP), 25 mM HEPES (pH 7,3) (Arquivo Suplementar 1) e milrinona (2,5 mM) (MEM/PVP + M, consulte a Tabela de Materiais). Preparar os pratos de coleta e cultura, fazer quatro microgotas (100 μL) de meio de coleta (MEM/PVP + M) e duas microgotas (100 μL) de meio de cultura (CZB + M) em placas de Petri de 60 mm e 35 mm, respectivamente, e cobri-las com óleo mineral (ver Tabela de Materiais). Mantenha o prato de coleta na lâmina mais quente e coloque o prato de cultura na incubadora a 37 °C e 5% de CO2. Injetar por via intraperitoneal 5 UI de gonadotrofina sérica de égua grávida (PMSG, ver Tabela de Materiais) em ratas fêmeas Cep192-eGFP sexualmente maduras (6-8 semanas de idade) 44-48 h antes da recolha de ovócitos. Sacrificar os camundongos por luxação cervical, identificar e remover os ovários21 e transferi-los para um vidro de relógio contendo meio de coleta pré-aquecido (MEM/PVP + M) a 37 °C. Fixe o ovário tocando uma seringa de 1 ml no fundo do vidro do relógio e perfurando-o várias vezes (~ 40 vezes por ovário) usando agulhas de costura agrupadas para liberar os oócitos no meio. Usando uma pipeta de transferência de plástico, transfira todo o meio que contém os complexos cumulus-ovócitos (COCs) da etapa 1.7 para uma placa de Petri de plástico vazia de 100 mm. Sob um estereomicroscópio, colete os COCs usando uma pipeta de vidro Pasteur e transfira-os para o prato de coleta que contém MEM / PVP + M. Usando uma pipeta de vidro Pasteur estreita (aproximadamente 100 μm de diâmetro), desnude os oócitos mecanicamente por pipetagem repetitiva suave, seguida de transferi-los e lavá-los em quatro microgotas de (100 μL) MEM/PVP + M (o prato de coleta) antes de sua transferência para o prato de cultura CZB + M. Incubar os ovócitos desnudados durante 1 h a 37 °C com 5% de CO2 no ar. 2. Microinjeção de ovócitos Coloque uma gota de 250 μL de MEM/PVP + M em uma tampa de placa de Petri de plástico de 100 mm e cubra-a com óleo mineral.NOTA: A tampa da placa de Petri tem um aro inferior que fornece mais espaço para ajustar o micromanipulador. Ligue o sistema de microinjeção (consulte a Tabela de Materiais). Colocar a placa de microinjeção na fase de aquecimento (37 °C) do microscópio. Carregue a agulha de injeção com 0,5 μL de cRNA mCh-Cep192usando as pontas da pipeta do microcarregador (consulte Tabela de Materiais) e prenda a agulha de injeção ao micromanipulador. Transferir os ovócitos desnudos (etapa 1.11) para a microgota de 250 μL (etapa 2.1). Sob uma lente objetiva de 20x ou 40x, ajuste a posição e o foco das agulhas de injeção e de retenção de acordo com a posição do ovócito (Figura 1). Configure a unidade de microinjeção e defina a pressão de injeção (p i), a pressão de compensação (pc) e o tempo de injeção (ti) para poder injetar 5-10 pl de cRNA mCh-Cep192 (para rotular exogenamente os MTOCs). Injete cuidadosamente os oócitos sem tocar no núcleo. Uma vez que todos os ovócitos são injetados, lave-os em três microgotas de CZB + M, transfira-os para a placa de cultura (CZB + M) e incube-os por 3 h a 37 °C para permitir a expressão de mCh-Cep192. 3. Maturação dos ovócitos Preparar o meio de maturação adicionando glutamina (1 mM) a um meio CZB pré-equilibrado numa incubadora com 5% de CO2 no ar a 37 °C durante, pelo menos, 3 h. Faça duas microgotas (100 μL) do meio de maturação em uma placa de Petri de 35 mm e cubra-as com óleo mineral (placa de maturação). Lave os ovócitos presos à prófase I pelo menos três vezes em microgotas de CZB isentas de milrinona de 100 μL para remover completamente a milrinona e permitir a retomada meiótica. Transferir os ovócitos para a placa de maturação e incubá-los por 5 h (estágio de prometáfase I) em incubadora umidificada com 5% de CO2 em ar a 37 °C. 4. Preparação de ovócitos para ablação e imagem Transferir os ovócitos da prometáfase I (etapa 3.4) para uma placa de cultura com fundo de vidro contendo 100 μL de meio de maturação (etapa 3.1) coberto com óleo mineral. 5. Preparação do microscópio para ablação Pelo menos 30 min antes da ablação, ligue o controlador de temperatura da incubadora de palco (ver Tabela de Materiais) e fixe-o a 37 °C. Ligue o controlador de CO 2 e defina-o em 5% de CO2. Selecione uma objetiva apocromática de imersão em óleo de 40x e aplique uma pequena gota do óleo de imersão. Monte o prato de cultura com fundo de vidro com os oócitos em uma incubadora de topo de palco e cubra a incubadora com uma tampa de gás. No software de aquisição de imagens (consulte a Tabela de Materiais), selecione uma opção que permita salvar várias posições de estágio (por exemplo, “Definir marca e encontrar experimento”). Usando a iluminação de campo brilhante de luz transmitida, centralize nos ovócitos individuais e salve suas posições. No software de aquisição de imagens, selecione o modo de digitalização XYZ , defina o formato da imagem como 256 x 256 pixels, defina o fator de zoom como 2,5x – 3,0x e selecione uma frequência de digitalização de 600 Hz. Isso corresponde a um tempo de permanência de pixels de aproximadamente 1,6 μs. Defina uma linha de laser de excitação de 488 nm a aproximadamente 10% da potência do laser (o que corresponde a 4,0 μW no nível da amostra) (veja Tabela de Materiais) e use uma largura de banda espectral de 500-550 nm para observar o sinal GFP dos MTOCs. Para a observação simultânea da fluorescência do Cep192 marcado com mCherry, defina uma linha de laser de excitação de 585 nm em aproximadamente 8% da potência do laser (o que corresponde a 10,7 μW no nível da amostra) e use outro detector ajustado para uma largura de banda espectral de 595-645 nm.NOTA: É útil usar o detector de luz transmitida (TLD) do microscópio confocal para detectar simultaneamente os limites dos ovócitos. Usando um modo de varredura ao vivo e o controle manual da unidade z, filtre o ovócito para MTOCs. Uma vez que um mcMTOC é detectado, desenhe uma região quadrada de interesse (ROI) em torno dele. 6. Ablação de mcMTOCs Defina um laser de femtossegundo para um comprimento de onda de 740 nm.NOTA: O comprimento de onda do laser pode ser alterado de acordo com o microscópio e as condições do laser. Use o modulador eletro-óptico do microscópio multifóton (ver Tabela de Materiais) para definir a potência do laser para 70%-80%, correspondendo à potência de 60-70 mW no plano da amostra.NOTA: Se o laser estiver equipado com um compensador de pulso de femtossegundos, use-o para corrigir a dispersão de atraso de grupo (GDD). A correção de GDD reduz a quantidade de energia do laser necessária para uma ablação eficiente do mcMTOC e minimiza os fotodanos ao ovócito. O controle GDD é geralmente integrado com o software de aquisição de imagem de microscópios multifótons comerciais. Use o mesmo formato de imagem, fator de zoom e frequência de digitalização como na etapa 5.6. Defina os parâmetros de média de linha e quadro como 1. Clique no botão Scan no software para realizar a ablação do mcMTOC realizando uma única varredura a laser do ROI selecionado. Use as configurações de canal da etapa 5.7 para revisar os resultados da ablação comparando as imagens das estruturas marcadas com GFP tiradas antes e depois da exposição ao laser multifóton. Se a ablação for bem-sucedida, a intensidade da fluorescência da GFP no mcMTOC alvo diminui para os níveis observados no fundo. Se alguns fragmentos de uma estrutura de marcação GFP permanecerem, repita a etapa 6.4 uma ou mais vezes, concentrando-se em vários planos z do mcMTOC. Use as configurações de canal da etapa 5.7 para verificar a eficiência da ablação pela perda completa de sinais mCherry associados ao mcMTOC (mCh-Cep192). Repita a etapa 5.8 para a etapa 6.7 até que todos os MTOCs de um ovócito (em vários planos focais) sejam ablados.NOTA: Este protocolo usa a microinjeção mCh-Cep192 como uma estratégia para confirmar a depleção de mcMTOC após a exposição ao laser multifóton e excluir a possibilidade de que a perda de fluorescência de GFP seja causada pelo fotobranqueamento de GFP. No entanto, a microinjeção desta sonda é opcional e não é necessária para o procedimento de ablação.