Ablazione laser multi-fotone di centri di organizzazione di microtubuli citoplasmatici in ovociti di topo

Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dall’Università del Missouri (Animal Care Quality Assurance Ref. Number 9695). Nel presente studio sono stati utilizzati topi femmina reporter Cep192-eGFP di età compresa tra 6 e 8 settimane. Per generare topi reporter Cep192-eGFP , è stata utilizzata la riparazione diretta dall’omologia mediata da CRISPR / Cas9 per integrare il gene reporter EGFP nel genoma del topo CF-1. Il reporter EGFP è stato fuso al C-terminus di Cep192 (una componente integrante degli MTOC)15. Per mantenere la colonia di topi, sono stati utilizzati topi reporter omozigoti Cep192-eGfp . Tutti gli animali sono stati tenuti in gabbie (fino a quattro animali / gabbia) a 21 ° C e 55% di umidità, con un ciclo luce / buio di 12 ore e accesso ad libitum a cibo e acqua. 1. Raccolta di ovociti di topo Preparare il terreno di coltura (Chatot, Ziomek e Bavister, CZB19, vedere la tabella dei materiali) e incubarlo a 37 °C e al 5% di CO2 durante la notte.NOTA: Il mezzo CZB può essere conservato a 4 °C per 1 mese (vedere il file supplementare 1 per la composizione del supporto). Integrare il terreno CZB con glutammina (1 mM) e milrinone (2,5 mM) (CZB + M) (vedi Tabella dei materiali) e metterlo nell’incubatore.NOTA: Il milrinone è un inibitore della fosfodiesterasi che mantiene gli ovociti arrestati alla profase I e impedisce la ripresa meiotica20. Preparare il mezzo di raccolta (terreno essenziale minimo privo di bicarbonato, MEM) contenente 3 mg/ml di polivinilpirolidone (PVP), 25 mM HEPES (pH 7,3) (File supplementare 1) e milrinone (2,5 mM) (MEM/PVP + M, vedere la tabella dei materiali). Preparare i piatti di raccolta e coltura, preparare quattro microgocce (100 μL) di terreno di raccolta (MEM / PVP + M) e due microgocce (100 μL) di terreno di coltura (CZB + M) in piastre di Petri da 60 mm e 35 mm, rispettivamente, e coprirle con olio minerale (vedi Tabella dei materiali). Tenere il piatto di raccolta sul vetrino più caldo e mettere il piatto di coltura nell’incubatore a 37 °C e 5% di CO2. Iniettare per via intraperitoneale 5 UI di gonadotropina sierica di cavalla gravida (PMSG, vedere la tabella dei materiali) in topi femmina sessualmente maturi (6-8 settimane) Cep192-eGFP 44-48 ore prima della raccolta degli ovociti. Sacrificare i topi mediante lussazione cervicale, identificare e rimuovere le ovaie21 e trasferirle in un vetro da orologio contenente terreno di raccolta preriscaldato (MEM / PVP + M) a 37 ° C. Fissare l’ovaia toccando una siringa da 1 mL sul fondo del vetro dell’orologio e perforandola più volte (~ 40 volte per ovaio) usando aghi da cucito raggruppati insieme per rilasciare gli ovociti nel mezzo. Utilizzando un pipetta di trasferimento in plastica, trasferire tutto il mezzo contenente i complessi cumulo-ovocita (COC) dal punto 1.7 in una capsula di Petri di plastica vuota da 100 mm. Sotto uno stereomicroscopio, raccogliere i COC utilizzando un pipet di vetro Pasteur e trasferirli nel piatto di raccolta che contiene MEM / PVP + M. Utilizzando un pipetta di vetro Pasteur stretto (circa 100 μm di diametro), denudare meccanicamente gli ovociti mediante un delicato pipettaggio ripetitivo, seguito dal trasferimento e dal lavaggio in quattro microgocce di (100 μL) MEM/PVP + M (il piatto di raccolta) prima del loro trasferimento nel piatto di coltura CZB + M. Incubare gli ovociti denudati per 1 ora a 37 °C con il 5% di CO2 nell’aria. 2. Microiniezione di ovociti Introdurre una goccia da 250 μL di MEM/PVP + M in un coperchio in plastica di Petri da 100 mm e coprirlo con olio minerale.NOTA: Il coperchio della piastra di Petri ha un bordo inferiore che offre più spazio per la regolazione del micromanipolatore. Accendere il sistema di microiniezione (vedere la tabella dei materiali). Posizionare il piatto di microiniezione sullo stadio di riscaldamento (37 °C) del microscopio. Caricare l’ago per iniezione con 0,5 μL di cRNA mCh-Cep192utilizzando le punte delle pipette del microcaricatore (vedere Tabella dei materiali) e fissare l’ago per iniezione al micromanipolatore. Trasferire gli ovociti denudati (fase 1.11) nella microgoccia da 250 μL (fase 2.1). Sotto una lente obiettivo 20x o 40x, regolare la posizione e la messa a fuoco degli aghi per iniezione e di tenuta in base alla posizione dell’ovocita (Figura 1). Impostare l’unità di microiniezione e impostare la pressione di iniezione (p i), la pressione di compensazione (pc) e il tempo di iniezione (ti) per essere in grado di iniettare 5-10 pl di cRNA mCh-Cep192 (per marcare esogenamente gli MTOC). Iniettare con cura gli ovociti senza toccare il nucleo. Una volta iniettati tutti gli ovociti, lavarli in tre microgocce di CZB + M, trasferirli nel piatto di coltura (CZB + M) e incubarli per 3 ore a 37 °C per consentire l’espressione di mCh-Cep192. 3. Maturazione degli ovociti Preparare il mezzo di maturazione aggiungendo glutammina (1 mM) al mezzo CZB pre-equilibrato in un incubatore con il 5% di CO2 in aria a 37 °C per almeno 3 ore. Fare due microgocce (100 μL) del mezzo di maturazione in una capsula di Petri da 35 mm e coprirle con olio minerale (piatto di maturazione). Lavare gli ovociti arrestati in profase I almeno tre volte in microgocce CZB prive di milrinone da 100 μL per rimuovere completamente il milrinone e consentire la ripresa meiotica. Trasferire gli ovociti nel piatto di maturazione e incubarli per 5 ore (stadio di prometafase I) in un incubatore umidificato con il 5% di CO2 in aria a 37 °C. 4. Preparazione degli ovociti per l’ablazione e l’imaging Trasferire gli ovociti di prometafase I (fase 3.4) in una capsula di coltura a fondo di vetro contenente 100 μL di terreno di maturazione (fase 3.1) ricoperta di olio minerale. 5. Preparazione al microscopio per l’ablazione Almeno 30 minuti prima dell’ablazione, accendere il regolatore di temperatura per l’incubatore dello stadio (vedere Tabella dei materiali) e impostarlo a 37 °C. Accendere il controller CO 2 e impostarlo su 5% CO2. Selezionare un obiettivo apocromatico ad immersione in olio 40x e applicare una piccola goccia dell’olio ad immersione. Montare il piatto di coltura con fondo di vetro con gli ovociti su un’incubatrice da palcoscenico e coprire l’incubatrice con un coperchio a gas. Nel software di acquisizione delle immagini (vedere la tabella dei materiali), selezionare un’opzione che consente il salvataggio di più posizioni di fase (ad esempio, “Definisci segna e trova esperimento”). Utilizzando l’illuminazione a luce luminosa trasmessa, centrare i singoli ovociti e salvare le loro posizioni. Nel software di acquisizione immagini, selezionare la modalità di scansione XYZ , impostare il formato dell’immagine su 256 x 256 pixel, impostare il fattore di zoom su 2,5x – 3,0x e selezionare una frequenza di scansione di 600 Hz. Ciò corrisponde a un tempo di permanenza dei pixel di circa 1,6 μs. Impostare una linea laser di eccitazione a 488 nm a circa il 10% della potenza del laser (che corrisponde a 4,0 μW a livello del campione) (vedere Tabella dei materiali) e utilizzare una larghezza di banda spettrale di 500-550 nm per osservare il segnale GFP dagli MTOC. Per l’osservazione simultanea della fluorescenza dal Cep192 marcato con mCherry, impostare una linea laser di eccitazione a 585 nm a circa l’8% della potenza del laser (che corrisponde a 10,7 μW a livello del campione) e utilizzare un altro rivelatore impostato su una larghezza di banda spettrale di 595-645 nm.NOTA: È utile utilizzare il rilevatore di luce trasmessa (TLD) del microscopio confocale per rilevare contemporaneamente i confini degli ovociti. Utilizzando una modalità di scansione dal vivo e il controllo manuale dello z-drive, eseguire lo screening dell’ovocita per gli MTOC. Una volta rilevato un mcMTOC, disegna una regione quadrata di interesse (ROI) attorno ad esso. 6. Ablazione di mcMTOCs Impostare un laser a femtosecondi su una lunghezza d’onda di 740 nm.NOTA: La lunghezza d’onda del laser può essere modificata in base al microscopio e alle condizioni del laser. Utilizzare il modulatore elettro-ottico del microscopio multi-fotone (vedi Tabella dei materiali) per impostare la potenza del laser al 70% -80%, corrispondente alla potenza di 60-70 mW sul piano del campione.NOTA: Se il laser è dotato di un compensatore di impulsi a femtosecondi, utilizzarlo per correggere la dispersione del ritardo di gruppo (GDD). La correzione GDD riduce la quantità di potenza laser necessaria per un’ablazione efficiente di mcMTOC e minimizza il fotodanneggiamento dell’ovocita. Il controllo GDD è solitamente integrato con il software di acquisizione immagini dei microscopi multifotoni commerciali. Utilizzare lo stesso formato immagine, fattore di zoom e frequenza di scansione del passaggio 5.6. Impostate i parametri di media di linee e fotogrammi su 1. Fare clic sul pulsante Scan nel software per eseguire l’ablazione del mcMTOC eseguendo una singola scansione laser del ROI selezionato. Utilizzare le impostazioni del canale dal passaggio 5.7 per rivedere i risultati dell’ablazione confrontando le immagini delle strutture marcate con GFP prese prima e dopo l’esposizione laser multi-fotone. Se l’ablazione ha successo, l’intensità della fluorescenza GFP nel mcMTOC mirato diminuisce ai livelli osservati sullo sfondo. Se rimangono alcuni frammenti di una struttura di etichettatura GFP, ripetere il passaggio 6.4 una o più volte concentrandosi su vari piani z del mcMTOC. Utilizzare le impostazioni del canale dal passaggio 5.7 per verificare l’efficienza di ablazione mediante la perdita completa dei segnali mCherry associati a mcMTOC (mCh-Cep192). Ripetere il passaggio da 5.8 al punto 6.7 fino a quando tutti gli MTOC di un ovocita (su vari piani focali) sono ablati.NOTA: Questo protocollo utilizza la microiniezione mCh-Cep192 come strategia per confermare la deplezione di mcMTOC dopo esposizione laser multi-fotone ed escludere la possibilità che la perdita di fluorescenza GFP sia causata dal fotosbiancamento GFP. Tuttavia, la microiniezione di questa sonda è facoltativa e non richiesta per la procedura di ablazione.