Ablation laser multiphotonique de centres organisateurs de microtubules cytoplasmiques dans les ovocytes de souris

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvées par l’Université du Missouri (Animal Care Quality Assurance Réf. numéro 9695). Des souris femelles rapporteures Cep192-eGFP âgées de 6 à 8 semaines ont été utilisées dans la présente étude. Pour générer des souris rapporteures Cep192-eGFP , la réparation dirigée par homologie médiée par CRISPR / Cas9 a été utilisée pour intégrer le gène rapporteur EGFP dans le génome de la souris CF-1. Le rapporteur EGFP a été fusionné à l’extrémité C du Cep192 (une partie intégrante des MTOC)15. Pour maintenir la colonie de souris, des souris rapporteures homozygotes Cep192-eGfp ont été utilisées. Tous les animaux ont été maintenus dans des cages (jusqu’à quatre animaux/cage) à 21 °C et 55% d’humidité, avec un cycle lumière/obscurité de 12 h et un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau. 1. Collecte d’ovocytes de souris Préparer le milieu de culture (Chatot, Ziomek et Bavister, CZB19, voir le tableau des matériaux) et l’incuber à 37 °C et 5% de CO2 pendant la nuit.REMARQUE: Le support CZB peut être conservé à 4 °C pendant 1 mois (voir Fichier supplémentaire 1 pour la composition du support). Complétez le milieu CZB avec de la glutamine (1 mM) et de la milrinone (2,5 mM) (CZB + M) (voir tableau des matériaux) et placez-le dans l’incubateur.NOTE: Milrinone est un inhibiteur de la phosphodiestérase qui maintient les ovocytes arrêtés à la prophase I et empêche la reprise méiotique20. Préparer le milieu de collecte (milieu essentiel minimal sans bicarbonate, MEM) contenant 3 mg/mL de polyvinylpyrolidone (PVP), 25 mM HEPES (pH 7,3) (dossier supplémentaire 1) et milrinone (2,5 mM) (MEM/PVP + M, voir le tableau des matières). Préparer les boîtes de collecte et de culture, faire quatre microgouttes (100 μL) de milieu de collecte (MEM/PVP + M) et deux microgouttes (100 μL) de milieu de culture (CZB + M) dans des boîtes de Petri de 60 mm et 35 mm, respectivement, et les recouvrir d’huile minérale (voir Tableau des matériaux). Conserver le plat de collecte sur le chauffe-lames et mettre le plat de culture dans l’incubateur à 37 °C et 5% de CO2. Injecter par voie intrapéritonéale 5 UI de gonadotrophine sérique de jument gravide (PMSG, voir le tableau des matières) à des souris femelles rapporteures Cep192-eGFP sexuellement matures (6-8 semaines) 44-48 h avant le prélèvement d’ovocytes. Sacrifier les souris par luxation cervicale, identifier et enlever les ovaires21, et les transférer dans un verre de montre contenant un milieu de collecte préchauffé (MEM/PVP + M) à 37 °C. Fixez l’ovaire en touchant une seringue de 1 mL au fond du verre de montre et en le perforant plusieurs fois (~40 fois par ovaire) à l’aide d’aiguilles à coudre regroupées ensemble pour libérer les ovocytes dans le milieu. À l’aide d’une pipette de transfert en plastique, transférer tout le milieu contenant les complexes cumulus-ovocytes (COC) de l’étape 1.7 dans une boîte de Petri en plastique vide de 100 mm. Sous un stéréomicroscope, recueillir les COC à l’aide d’une pipette en verre Pasteur et les transférer dans la boîte de collecte contenant MEM/PVP + M. À l’aide d’une pipette étroite en verre Pasteur (environ 100 μm de diamètre), dénuder mécaniquement les ovocytes par pipetage doux et répétitif, puis les transférer et les laver en quatre microgouttes de (100 μL) MEM/PVP + M (le plat de collecte) avant leur transfert dans la boîte de culture CZB + M. Incuber les ovocytes dénudés pendant 1 h à 37 °C avec 5% de CO2 dans l’air. 2. Microinjection ovocytaire Placez une goutte de 250 μL de MEM/PVP + M dans un couvercle de boîte de Petri en plastique de 100 mm et recouvrez-le d’huile minérale.REMARQUE: Le couvercle de la boîte de Petri a un bord inférieur qui offre plus d’espace pour ajuster le micromanipulateur. Allumez le système de micro-injection (voir le tableau des matériaux). Placer la boîte de micro-injection sur l’étage de réchauffement (37 °C) du microscope. Chargez l’aiguille d’injection avec 0,5 μL d’ARNc mCh-Cep192à l’aide des pointes de pipette du microchargeur (voir le tableau des matériaux) et fixez l’aiguille d’injection au micromanipulateur. Transférer les ovocytes dénudés (étape 1.11) dans la microgoutte de 250 μL (étape 2.1). Sous un objectif 20x ou 40x, ajuster la position et la mise au point des aiguilles d’injection et de maintien en fonction de la position de l’ovocyte (Figure 1). Configurez l’unité de micro-injection et réglez la pression d’injection (p i), la pression de compensation (pc) et le temps d’injection (ti) pour pouvoir injecter 5 à 10 pl d’ARNc mCh-Cep192 (pour marquer exogène les MTOC). Injectez soigneusement les ovocytes sans toucher le noyau. Une fois tous les ovocytes injectés, lavez-les en trois microgouttes de CZB + M, transférez-les dans la boîte de culture (CZB + M) et incuberez-les pendant 3 h à 37 °C pour permettre l’expression de mCh-Cep192. 3. Maturation ovocytaire Préparer le milieu de maturation en ajoutant de la glutamine (1 mM) au milieu CZB pré-équilibré dans un incubateur avec 5% de CO2 dans l’air à 37 °C pendant au moins 3 h. Faire deux microgouttes (100 μL) du milieu de maturation dans une boîte de Petri de 35 mm et les recouvrir d’huile minérale (boîte de maturation). Lavez les ovocytes arrêtés par la prophase I au moins trois fois dans des microgouttes CZB sans milrinone de 100 μL pour éliminer complètement la milrinone et permettre la reprise méiotique. Transférer les ovocytes dans la boîte de maturation et les incuber pendant 5 h (stade prométaphase I) dans un incubateur humidifié contenant 5% de CO2 dans l’air à 37 °C. 4. Préparation ovocytaire pour l’ablation et l’imagerie Transférer les ovocytes de la prométaphase I (étape 3.4) dans une capsule de culture à fond de verre contenant 100 μL de milieu de maturation (étape 3.1) recouverte d’huile minérale. 5. Préparation au microscope pour l’ablation Au moins 30 minutes avant l’ablation, allumez le régulateur de température de l’incubateur de scène (voir Tableau des matériaux) et réglez-le à 37 °C. Allumez le contrôleur de CO 2 et réglez-le à 5% CO2. Sélectionnez un objectif apochromatique d’immersion dans l’huile 40x et appliquez une petite goutte de l’huile d’immersion. Montez le plat de culture à fond de verre avec les ovocytes sur un incubateur de scène et couvrez l’incubateur avec un couvercle de gaz. Dans le logiciel d’acquisition d’images (voir le tableau des matériaux), sélectionnez une option permettant d’enregistrer plusieurs positions de scène (par exemple, « Définir la marque et trouver l’expérience »). À l’aide de l’éclairage en fond clair transmis par la lumière, centrez sur les ovocytes individuels et enregistrez leurs positions. Dans le logiciel d’acquisition d’images, sélectionnez le mode de numérisation XYZ, définissez le format d’image sur 256 x 256 pixels, réglez le facteur de zoom sur 2,5x – 3,0x et sélectionnez une fréquence de numérisation de 600 Hz. Cela correspond à un temps de séjour des pixels d’environ 1,6 μs. Régler une raie laser d’excitation de 488 nm à environ 10 % de la puissance laser (ce qui correspond à 4,0 μW au niveau de l’échantillon) (voir le tableau des matériaux) et utiliser une largeur de bande spectrale de 500 à 550 nm pour observer le signal GFP des COMT. Pour l’observation simultanée de la fluorescence du Cep192 marqué mCherry, réglez une raie laser d’excitation de 585 nm à environ 8% de la puissance laser (ce qui correspond à 10,7 μW au niveau de l’échantillon) et utilisez un autre détecteur réglé sur une bande passante spectrale de 595-645 nm.REMARQUE: Il est utile d’utiliser le détecteur de lumière transmise (TLD) du microscope confocal pour détecter simultanément les limites ovocytaires. À l’aide d’un mode de balayage en direct et du contrôle manuel du z-drive, analysez l’ovocyte pour les MTOC. Une fois qu’un mcMTOC est détecté, dessinez une région d’intérêt carrée (ROI) autour de lui. 6. Ablation des mcMTOCs Réglez un laser femtoseconde sur une longueur d’onde de 740 nm.REMARQUE: La longueur d’onde du laser peut être modifiée en fonction du microscope et des conditions du laser. Utilisez le modulateur électro-optique du microscope multiphotonique (voir Tableau des matériaux) pour régler la puissance laser à 70%-80%, correspondant à une puissance de 60-70 mW au plan d’échantillonnage.REMARQUE: Si le laser est équipé d’un compensateur d’impulsion femtoseconde, utilisez-le pour corriger la dispersion de retard de groupe (GDD). La correction GDD réduit la quantité de puissance laser requise pour une ablation efficace du mcMTOC et minimise les photodommages à l’ovocyte. Le contrôle GDD est généralement intégré au logiciel d’acquisition d’images des microscopes multiphotoniques commerciaux. Utilisez le même format d’image, le même facteur de zoom et la même fréquence de numérisation qu’à l’étape 5.6. Définissez les paramètres de moyenne de ligne et d’image sur 1. Cliquez sur le bouton Scan dans le logiciel pour effectuer l’ablation du mcMTOC en effectuant un seul scan laser du ROI sélectionné. Utilisez les paramètres de canal de l’étape 5.7 pour examiner les résultats de l’ablation en comparant les images des structures marquées GFP prises avant et après l’exposition laser multiphotonique. Si l’ablation réussit, l’intensité de la fluorescence GFP dans le mcMTOC ciblé diminue aux niveaux observés en arrière-plan. S’il reste quelques fragments d’une structure d’étiquetage GFP, répétez l’étape 6.4 une ou plusieurs fois en vous concentrant sur différents plans z du mcMTOC. Utilisez les paramètres de canal de l’étape 5.7 pour vérifier l’efficacité d’ablation par la perte complète des signaux mCherry associés à mcMTOC (mCh-Cep192). Répétez les étapes 5.8 à 6.7 jusqu’à ce que tous les MTOCs d’un ovocyte (à différents plans focaux) soient ablés.REMARQUE: Ce protocole utilise la microinjection mCh-Cep192 comme stratégie pour confirmer la déplétion du mcMTOC après une exposition au laser multiphotonique et exclure la possibilité que la perte de fluorescence GFP soit causée par le photoblanchiment GFP. Cependant, la micro-injection de cette sonde est facultative et n’est pas requise pour la procédure d’ablation.