الاجتثاث بالليزر متعدد الفوتون لمراكز تنظيم الأنابيب الدقيقة السيتوبلازمية في بويضات الفأر
Summary
يتم تقديم بروتوكول محسن يتيح استنفاد مراكز تنظيم الأنابيب الدقيقة السيتوبلازمية في بويضات الفئران أثناء الطور الاستوائي الأول باستخدام ليزر الفيمتو ثانية القريب من الأشعة تحت الحمراء.
Abstract
تعد دقة الانقسام الاختزالي للخلايا البيضية أمرا بالغ الأهمية لتوليد بويضات euploid مؤهلة من الناحية التنموية. في الثدييات ، تخضع البويضة لاعتقال طويل في المرحلة الأولى من الانقسام الاختزالي الأول. بعد البلوغ وعند الاستئناف الاختزالي ، يتفكك الغشاء النووي (انهيار الغلاف النووي) ، ويتم تجميع المغزل بشكل أساسي في مركز البويضة. يعد وضع المغزل المركزي الأولي ضروريا للحماية من مرفقات الأنابيب الدقيقة الحركية (MT) غير الطبيعية واختلال الصيغة الصبغية. يهاجر المغزل ذو الموقع المركزي بطريقة حساسة للوقت نحو القشرة ، وهذه عملية ضرورية لقذف جسم قطبي صغير. في الخلايا الانقسامية ، يعتمد وضع المغزل على التفاعل بين MTs النجمي بوساطة المركز وقشرة الخلية. على العكس من ذلك ، تفتقر بويضات الفئران إلى الجسيمات المركزية الكلاسيكية ، وبدلا من ذلك ، تحتوي على العديد من مراكز تنظيم MT اللامركزية (MTOCs). في المرحلة الفوقية الأولى ، تحتوي بويضات الفئران على مجموعتين مختلفتين من MTOCs: (1) MTOCs التي يتم تجميعها وفرزها لتجميع أقطاب المغزل (MTOCs القطبية) ، و (2) MTOCs السيتوبلازمية الطورية (mcMTOCs) التي تبقى في السيتوبلازم ولا تساهم بشكل مباشر في تكوين المغزل ولكنها تلعب دورا حاسما في تنظيم وضع المغزل وهجرة المغزل في الوقت المناسب. هنا ، يتم وصف طريقة الاجتثاث بالليزر متعدد الفوتونات لاستنفاد mcMTOCs الموسومة داخليا بشكل انتقائي في البويضات التي تم جمعها من الفئران المراسلة Cep192-eGfp . تساهم هذه الطريقة في فهم الآليات الجزيئية الكامنة وراء وضع المغزل والهجرة في بويضات الثدييات.
Introduction
تنتج الجاميتات الأحادية الصيغة الصبغية (الحيوانات المنوية والخلايا البيضية) من خلال الانقسام الميوزي، الذي يستلزم جولة واحدة من تضاعف الحمض النووي (DNA) يتبعها قسمان متتاليان ضروريان لتقليل عدد الكروموسومات قبل الإخصاب. في الثدييات ، خلال الحياة الجنينية المبكرة ، تخضع الخلية البيضية لتوقف طويل (حتى سن البلوغ) في مرحلة diplotene من الطور التمهيدي الأول من الانقسام الميوتي الأول ، وهي مرحلة تسمى مرحلة الحويصلة الجرثومية (GV). بعد الاستئناف الاختزالي ، تخضع بويضة GV لانهيار الغلاف النووي (NEBD) ، ويتم تجميع المغزل بشكل أساسي في مركز البويضة1،2،3. في وقت لاحق ، مدفوعا ب F-actin ، يهاجر المغزل في الوقت المناسب من مركز البويضة إلى القشرة لضمان الانقسام غير المتماثل للغاية ، مما ينتج عنه بيضة ذات جسم قطبي صغير (PB) 4،5،6.
في الخلايا الانقسامية ، تتكون الجسيمات المركزية من زوج من المراكز المركزية محاطة بمكونات مادة شبه مركزية (PMC) ، مثل pericentrin و γ-tubulin و Cep152 و Cep1927. تساهم هذه الجسيمات المركزية المحتوية على المركز المركزي في دقة تكوين المغزل ثنائي القطب8. ومع ذلك ، يتم فقدان المراكز المركزية أثناء تكوين البويضات المبكر في أنواع مختلفة ، بما في ذلك القوارض9. لذلك ، تتبنى بويضات الفأر مسار تجميع مغزل مستقل عن المركز باستخدام العديد من مراكز تنظيم الأنابيب الدقيقة المركزية (MTOCs)9،10. عند الاستئناف الاختزالي ، تخضع MTOCs المحيطة بالنواة لثلاث خطوات متميزة من التكثيف والتمدد والتجزئة إلى عدد كبير من MTOCsالأصغر 11,12. ثم يتم تجميع MTOCs المجزأة وفرزها لتنظيم مغزل ثنائي القطب10،13،14. توجد مجموعة أخرى من MTOCs في السيتوبلازم أثناء NEBD. تهاجر بعض هذه MTOCs السيتوبلازمية وتشكل أقطاب مغزل (MTOCs القطبية ، pMTOCs)10,11. في الآونة الأخيرة ، تم اكتشاف مجموعة فرعية أخرى من MTOCs السيتوبلازمية ، تسمى MTOCs السيتوبلازمية الطورية (mcMTOCs) ، والتي لا تساهم في تكوين قطب المغزل ولكنها تبقى في سيتوبلازم الخلية البيضية أثناء الطور الاستوائي الأول (Met I)15. يؤدي استنفاد mcMTOCs عن طريق الاجتثاث بالليزر متعدد الفوتونات أو زيادة أعدادها بشكل غير طبيعي عن طريق تثبيط الالتهام الذاتي إلى اضطراب وضع المغزل والهجرة ويزيد من حدوث اختلال الصيغة الصبغية في بويضات الطور الثاني15.
ومن المثير للاهتمام ، أن mcMTOCs تختلف عن pMTOCs في العديد من الجوانب15. على سبيل المثال ، على عكس pMTOCs ، التي تنشأ بشكل أساسي من MTOCs المحيطة بالنواة ، تنشأ mcMTOCs من قشرة البويضة. عندما يكون المغزل لا يزال في مركز البويضة ، يتم توطين mcMTOCs بشكل غير متماثل مقابل الجانب الذي يهاجر إليه المغزل من أجل بثق PB15. لا يمكن ل MTs الشبيهة بالنجوم الوصول إلى القشرة في الخلية البيضية الكبيرة نسبيا. لذلك ، تقوم هذه MCMTOCs بنواة MTs لتثبيت المغزل (عبر MTOCs الشبيهة بالنجمية) إلى القشرة. تشير هذه النتائج إلى نموذج تتصدى فيه قوة MT ذات النواة mcMTOC للقوة بوساطة F-actin التي تدفع هجرة المغزل نحو القشرة. التوازن بين هاتين القوتين المتعارضتين ضروري لتنظيم وضع المغزل المركزي وهجرة المغزل في الوقت المناسب15.
حتى الآن ، تتمركز جميع بروتينات PMC التي تم فحصها (pericentrin و g-tubulin و Cep192 و Aurora kinase A) في كل من تجمعات MTOC: mcMTOCs و pMTOCs15. لذلك ، لا يوجد نهج كيميائي أو وراثي لإزعاج mcMTOCs بشكل انتقائي دون إزعاج pMTOCs. يمكن التحايل على هذه القيود عن طريق استهداف mcMTOCs بشكل انتقائي باستخدام الاجتثاث بالليزر. من بين التقنيات القائمة على الليزر التي تم تطويرها للاستئصال الدقيق ، تظهر ليزر الفيمتو ثانية النبضي متعدد الفوتون إمكانات كبيرة بسبب تأثيرها الدقيق الذي يقتصر على المستوى البؤري ، وعمق الاختراق العالي للضوء القريب من الأشعة تحت الحمراء ، وانخفاض السمية الضوئية والأضرار الحرارية للخلية16،17،18. يصف هذا العمل نهجا انتقائيا لاستئصال mcMTOCs في بويضات الفئران باستخدام ليزر متعدد الفوتونات مقترن بمجهر مقلوب.
Protocol
Representative Results
Discussion
توجد طرق مختلفة لإزعاج الهياكل المرتبطة بالهيكل الخلوي داخل الخلايا22،23،24،25. ومع ذلك ، فإن إيجاد تقنيات فعالة لإزعاج البنية المستهدفة بشكل انتقائي دون المساس بصلاحية الخلية يمثل تحديا. طريقة الاجتثاث بالليزر متعدد الفوتونات المعروضة هنا هي استراتيجية فعالة للحث على اضطراب ميكانيكي انتقائي ل mcMTOCs داخل البويضة دون تغيير صلاحية البويضة.
تم استخدام الاستئصال بالليزر على نطاق واسع لفهم الآليات الجزيئية التي تتحكم في فصل الكروموسومات أثناء الانقسام والانقسام الاختزالي22،23،26،27. نظرا للحجم الكبير نسبيا (>80 مم في القطر) لبويضات الثدييات مقارنة بالخلايا الجسدية28 ، فإن استئصال هياكلها داخل الخلايا يمثل تحديا. علاوة على ذلك ، فإن متوسط حجم mcMTOC في بويضات الطور الأول هو ~ 20 ميكرومتر15 ، مما يمثل تحديا إضافيا. يجب اعتماد طريقة فعالة توفر اختراقا أعمق للأنسجة للتغلب على هذه التحديات. الميزة الرئيسية لاستخدام الليزر متعدد الفوتونات للاستئصال هي قدرته على الوصول إلى عمق الخلية مع تقليل التأثيرات خارج الهدف29.
للتحقق من فعالية وكفاءة طريقة الاستئصال بالليزر لاستنفاد البنية المستهدفة ، يوصى باستخدام بروتين موسوم بالفلورسنت لتحديد البنية المستهدفة بمرور الوقت (قبل وبعد الاستئصال)23. من المهم ملاحظة أن الاجتثاث بالليزر يستنفد mcMTOC بالكامل كهيكل ، وعلى الرغم من أن mcMTOCs الأصغر تتطلب تعرضا واحدا فقط لليزر ليتم استنفادها ، فقد تتطلب mcMTOCs الأكبر حجما أكثر من تعرض ليزر واحد في مستويات بؤرية مختلفة. يوصى أيضا بإصلاح مجموعة فرعية من البويضات الضابطة والخلايا الاستئصالية المستأصلة ب mcMTOC وتسميتها المناعية باستخدام علامة MTOC (مثل γ-tubulin أو pericentrin أو Cep192) لتأكيد كفاءة استئصال mcMTOC بشكل أكبر. في البويضات الضابطة ، ستتعرض مناطق السيتوبلازم المجاورة ل mcMTOCs ولكنها لا تتداخل معها لليزر.
تتطلب هذه التجربة العديد من عمليات استئصال mcMTOC أثناء التنقل بين المستويات البؤرية المختلفة داخل البويضات. لذلك ، يوصى بشدة بممارسة هذه التقنية عدة مرات قبل تنفيذ التجربة لتقليل وقت التجربة ، وبالتالي زيادة صلاحية البويضة. علاوة على ذلك ، من المهم استخدام الحد الأدنى من طاقة الليزر الكافية لاستنفاد mcMTOCs دون التأثير على صلاحية البويضة.
هذه التقنية لها بعض القيود. أولا ، المجاهر متحدة البؤر متعددة الفوتونات أغلى نسبيا من المجاهر متحدة البؤر العادية. ثانيا ، إن إزعاج جميع MCMTOCs في مستويات بؤرية مختلفة يستغرق وقتا أطول من الاضطرابات الكيميائية أو الجينية. ثالثا ، يتطلب هذا البروتوكول مهارات تقنية لاستئصال جميع mcMTOCs في أقصر وقت ممكن. ومع ذلك ، بمجرد إتقانه ، يوفر استخدام الليزر متعدد الفوتونات استراتيجية ممتازة لإزعاج العديد من الهياكل داخل الخلايا في بويضات الفئران ، بما في ذلك mcMTOCs ، مما يساهم في فهم الآليات الجزيئية التي تنظم وضع المغزل وهجرته في الوقت المناسب في بويضات الثدييات.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يود المؤلفون أن يشكروا جميع أعضاء مختبر بالبولا على مساعدتهم ومناقشاتهم القيمة. يشكر المؤلفون ميلينا شوه على تفضلها بمشاركة بنية mCherry-Cep192. تم دعم هذه الدراسة من قبل R35GM142537 (NIGMS ، NIH) إلى AZB.
Materials
| 4 IN thinwall GL 1.0 OD/.75 ID | World precision instrument | TW100F-4 | Injection needles |
| Borosilicate glass | Fisherbrand | Cat# 13-678-20D | |
| Borosilicate glass capillarities | World Precision Instrument | Cat# TW100-6 | Holding needles |
| Bovine serum albumine | MilliporeSigma | Cat# A4503 | |
| Cage incubator for Leica DMI6000 B microscope | Life Imaging Services GmbH | ||
| Calcium chlrode dihydrate | MilliporeSigma | Cat# C7902 | |
| CO2 controller | Pecon | # 0506.000 | |
| CO2 Cover HP | Pecon | # 0506.020 | |
| DL-Lactic acid | MilliporeSigma | Cat# L7900 | |
| DMi8 | Leica | N/A | Microscope |
| EDTA | MilliporeSigma | Cat# E5134 | |
| Femtojet 4i | Eppendorf | N/A | Microinjector |
| Femtotips Microloader | Fisher scientific | E5242956003 | |
| Gentamicin | MilliporeSigma | Cat# G1272 | |
| Gentamycin | MilliporeSigma | Cat# 1272 | |
| Glass bottom dish | Mat Tek Corporation | Cat# P35G-1.0-20-C | |
| Hepes | MilliporeSigma | Cat# H3784 | |
| Hepes Sodium Salt | MilliporeSigma | Cat # H3784 | |
| Hera Cell vios 160i | Thermo | N/A | CO2 incubator |
| Leica TCP SP8 spectral laser scanning confocal micorscope with inverted stand DMI6000 B | Leica Microsystems, Inc | N/A | |
| L-Glutamine | MilliporeSigma | Cat#G8540 | |
| Magnesium sulfate dihydrate | MilliporeSigma | Cat# M7774 | |
| MaiTai DeepSee Ti-Sapphire femtosecond laser | Spectra-Physics | N/A | |
| mCH-Cep192 cRNA | N/A | ||
| Medium Essential Medium Eagle – MEM | MilliporeSigma | Cat #M0258 | |
| Milrinone | MilliporeSigma | Cat# M4659 | |
| Mineral oil | MilliporeSigma | Cat# M5310 | |
| Minimum essential medium eagle (MEM) | MilliporeSigma | Cat# M0268 – 1L | |
| Mouse: Cep192-eGFP reporter CF-1 | N/A | ||
| Petri dish (100 mm) | Fisherbrand | Cat# FB0875712 | |
| Petri dish (35 mm) | Corning | Cat# 430165 | |
| Petri dish (60 mm) | Falcon | Cat# 351007 | |
| Phenol Red | MilliporeSigma | Cat# P5530 | |
| Polyvinylpyrolidone | MilliporeSigma | Cat# P2307 | |
| Polyvinylpyrolidone (PVP) | MilliporeSigma | Cat# P2307 | |
| Potassium chloride | MilliporeSigma | Cat# P5405 | |
| Potassium phosphate monobasic | MilliporeSigma | Cat# P5655 | |
| Pregnant mare´s serum gonadotropin | Lee BioSolutions | Cat# 493-10-10 | |
| Pyruvic acid | MilliporeSigma | Cat# P4562 | |
| Pyruvic acid | MilliporeSigma | Cat# P4562 | |
| Sewing needles | D.M.C | N/A | N° 5 * 16 Needles |
| Sodium bicarbonate | MilliporeSigma | Cat# S5761 | |
| Sodium chloride | MilliporeSigma | Cat# S5886 | |
| Stage-top heating insert P | Pecon | # 0426.300 | |
| Sterezoom S9i | Leica | N/A | Stereomicroscope |
| Syringe 1 mL | BD company | Cat# 309597 | |
| Taurine | MilliporeSigma | Cat# T0625 | |
| Temperature controller Tempcontrol 37-2 digital | Pecon | # 0503.000 | |
| The Cube temperature controller for the cage incubator | Life Imaging Services GmbH |
Riferimenti
- Bennabi, I., Terret, M. E., Verlhac, M. H. Meiotic spindle assembly and chromosome segregation in oocytes. Journal of Cell Biology. 215 (5), 611-619 (2016).
- Hashimoto, N., Kishimoto, T. Regulation of meiotic metaphase by a cytoplasmic maturation-promoting factor during mouse oocyte maturation. Development Biology. 126 (2), 242-252 (1988).
- Kitajima, T. S., Ohsugi, M., Ellenberg, J. Complete kinetochore tracking reveals error-prone homologous chromosome biorientation in mammalian oocytes. Cell. 146 (4), 568-581 (2011).
- Azoury, J., Verlhac, M. H., Dumont, J. Actin filaments: Key players in the control of asymmetric divisions in mouse oocytes. Biology of the Cell. 101 (2), 69-76 (2009).
- Li, H., Guo, F., Rubinstein, B., Li, R. Actin-driven chromosomal motility leads to symmetry breaking in mammalian meiotic oocytes. Nature Cell Biology. 10 (11), 1301-1308 (2008).
- Schuh, M., Ellenberg, J. A new model for asymmetric spindle positioning in mouse oocytes. Current Biology. 18 (24), 1986-1992 (2008).
- Pimenta-Marques, A., Bettencourt-Dias, M. Pericentriolar material. Current Biology. 30 (12), 687-689 (2020).
- Hinchcliffe, E. H. The centrosome and bipolar spindle assembly: Does one have anything to do with the other. Cell Cycle. 10 (22), 3841-3848 (2011).
- Szollosi, D., Calarco, P., Donahue, R. P. Absence of centrioles in the first and second meiotic spindles of mouse oocytes. Journal of Cell Science. 11 (2), 521-541 (1972).
- Schuh, M., Ellenberg, J. Self-organization of MTOCs replaces centrosome function during acentrosomal spindle assembly in live mouse oocytes. Cell. 130 (3), 484-498 (2007).
- Clift, D., Schuh, M. A three-step MTOC fragmentation mechanism facilitates bipolar spindle assembly in mouse oocytes. Nature Communications. 6, 7217 (2015).
- Luksza, M., Queguigner, I., Verlhac, M. H., Brunet, S. Rebuilding MTOCs upon centriole loss during mouse oogenesis. Biologia dello sviluppo. 382 (1), 48-56 (2013).
- Balboula, A. Z., et al. Haspin kinase regulates microtubule-organizing center clustering and stability through Aurora kinase C in mouse oocytes. Journal of Cell Science. 129 (19), 3648-3660 (2016).
- Breuer, M., et al. HURP permits MTOC sorting for robust meiotic spindle bipolarity, similar to extra centrosome clustering in cancer cells. Journal of Cell Biology. 191 (7), 1251-1260 (2010).
- Londoño-Vásquez, D., Rodriguez-Lukey, K., Behura, S. K., Balboula, A. Z. Microtubule organizing centers regulate spindle positioning in mouse oocytes. Developmental Cell. 57 (2), 197-211 (2022).
- Konig, K., Riemann, I., Fischer, P., Halbhuber, K. J. Intracellular nanosurgery with near infrared femtosecond laser pulses. Cellular and Molecular Biology. 45 (2), 195-201 (1999).
- Galbraith, J. A., Terasaki, M. Controlled damage in thick specimens by multiphoton excitation. Molecular Biology of the Cell. 14 (5), 1808-1817 (2003).
- Maghelli, N., Tolic-Norrelykke, I. M. Laser ablation of the microtubule cytoskeleton: Setting up and working with an ablation system. Methods in Molecular Biology. 777, 261-271 (2011).
- Chatot, C. L., Ziomek, C. A., Bavister, B. D., Lewis, J. L., Torres, I. An improved culture medium supports development of random-bred 1-cell mouse embryos in vitro. Journal of Reproduction and Fertility. 86 (2), 679-688 (1989).
- Tsafriri, A., Chun, S. Y., Zhang, R., Hsueh, A. J., Conti, M. Oocyte maturation involves compartmentalization and opposing changes of cAMP levels in follicular somatic and germ cells: Studies using selective phosphodiesterase inhibitors. Biologia dello sviluppo. 178 (2), 393-402 (1996).
- Greaney, J., Subramanian, G. N., Ye, Y., Homer, H. Isolation and in vitro culture of mouse oocytes. Bio Protocol. 11 (15), 4104 (2021).
- Khodjakov, A., Cole, R. W., Rieder, C. L. A synergy of technologies: Combining laser microsurgery with green fluorescent protein tagging. Cell Motility and the Cytoskeleton. 38 (4), 311-317 (1997).
- Pavin, N., Tolic, I. M. Mechanobiology of the mitotic spindle. Developmental Cell. 56 (2), 192-201 (2021).
- Khodjakov, A., Cole, R. W., Oakley, B. R., Rieder, C. L. Centrosome-independent mitotic spindle formation in vertebrates. Current Biology. 10 (2), 59-67 (2000).
- Aist, J. R., Liang, H., Berns, M. W. Astral and spindle forces in PtK2 cells during anaphase B: a laser microbeam study. Journal of Cell Science. 104, 1207-1216 (1993).
- Bennabi, I., Manil-Segalen, M. Laser Ablation of microtubule-chromosome attachment in mouse oocytes. Methods in Molecular Biology. 1818, 153-161 (2018).
- Milas, A., Jagric, M., Martincic, J., Tolic, I. M. Optogenetic reversible knocksideways, laser ablation, and photoactivation on the mitotic spindle in human cells. Methods in Cell Biology. 145, 191-215 (2018).
- Warzych, E., Lipinska, P. Energy metabolism of follicular environment during oocyte growth and maturation. Journal of Reproduction and Development. 66 (1), 1-7 (2020).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
