Obtención de imágenes de la cóclea envejecida con microscopía de fluorescencia de lámina de luz

La cóclea es el órgano sensorial periférico para la audición en los mamíferos. Tiene una compleja anatomía en espiral de células sensoriales y de soporte repetitivas que están anatómicamente especializadas para detectar vibraciones sonoras y transmitirlas al cerebro para la percepción de la audición. Los principales elementos sensoriales son las células ciliadas internas y externas y sus fibras nerviosas inervantes cuyos cuerpos celulares componen el ganglio espiral, que reside dentro del canal de Rosenthal (Figura 1). Estas estructuras sensoriales y neuronales están dispuestas tonotópicamente de tal manera que los sonidos de alta frecuencia se transducen en la base coclear y los sonidos de baja frecuencia se transducen en el ápice de la cóclea². Un mapa anatómico de esta distribución celular sensorial a lo largo de la longitud en espiral de la membrana basilar de soporte se denomina citococleografía³ y se puede comparar con la pérdida auditiva en función de la frecuencia como se muestra en un audiograma.

El laberinto membranoso de la cóclea, que está rodeado de hueso denso, hace que sea técnicamente difícil examinar más de una estructura coclear a la vez. Por lo tanto, la razón para desarrollar un microscopio de lámina de luz es producir secciones seriadas bien alineadas de la cóclea completa para que todas las estructuras cocleares puedan examinarse entre sí en reconstrucciones 3D. Voie et ^al.4 y Voie y Spelman⁵ diseñaron el primer microscopio de lámina de luz, llamado microscopio de sección óptica de fluorescencia plana ortogonal (OPFOS), para seccionar ópticamente toda la cóclea. Sin embargo, este microscopio nunca fue desarrollado comercialmente; por lo tanto, nuestro objetivo era construir un microscopio de lámina de luz llamado microscopio de imagen láser de hoja delgada (TSLIM; Figura 2). Los detalles de diseño y construcción de TSLIM se han publicado anteriormente⁸. TSLIM realizó varias mejoras sobre el OPFOS, incluido el uso de una cámara digital con poca luz frente a una cámara CCD para la recolección de imágenes, microposicionadores codificados ópticamente para un movimiento preciso y reproducible de la muestra a través de la hoja de luz, el uso de una cámara de muestra ópticamente clara disponible comercialmente y la tinción de rodamina en etanol en lugar de en la solución de limpieza para evitar la precipitación de manchas dentro del tejido. El desarrollo comercial de microscopios de lámina de luz como SPIM⁶ se ha centrado en imágenes de alta resolución de pequeñas muestras transparentes vivas, pero no son adecuadas para imágenes cocleares completas ya que carecen de una distancia de trabajo adecuada. Una revisión del desarrollo de otros microscopios de lámina de luz fue publicada por Santi⁷. La principal ventaja de TSLIM sobre otros métodos histológicos para examinar la cóclea es seccionar ópticamente los tejidos para la reconstrucción 3D mientras se preserva la integridad de la muestra para que pueda ser utilizada por otros métodos histológicos. Otra ventaja de las imágenes TSLIM es que solo una lámina de luz delgada producida por un láser se expone al tejido, en comparación con la exposición del espesor del tejido completo al láser como en la microscopía confocal. La limpieza del tejido para minimizar la dispersión de la luz y el hecho de que solo una pequeña porción del tejido está expuesta al láser da como resultado un desvanecimiento mínimo del fluorocromo (fotoblanqueo) con imágenes láser de lámina de luz. Sin embargo, el proceso de fijación, deshidratación y limpieza altera la morfología de las estructuras cocleares y da como resultado la contracción del tejido en comparación con el tejido vivo. No se determinó la cantidad real de contracción del tejido que se produce.

TSLIM fue desarrollado por Shane Johnson y ocho estudiantes alemanes de ingeniería óptica (ver Agradecimientos). Los detalles de construcción de TSLIM fueron proporcionados por Santi et ^al.8 y una versión de escaneo (sTSLIM) por Schröter et ^al.9. TSLIM funciona como un microtomo no destructivo para seccionar ópticamente muestras y como un microscopio para recolectar secciones seriadas 2D a través de todo el ancho y grosor de la cóclea. TSLIM puede obtener imágenes de especímenes gruesos pequeños (mm) y grandes (cm). Las lentes están montadas en el aire para permitir largas distancias de trabajo con objetivos de recolección de 1x y 2x en un microscopio de disección. El microscopio de disección también tiene óptica de zoom que permite a TSLIM resolver estructuras subcelulares y sinápticas en las células. TSLIM está equipado con un láser azul (473 nm) y verde (532 nm) para la iluminación que permite utilizar una variedad de sondas fluorescentes para la obtención de imágenes. El objetivo de TSLIM es producir secciones ópticas 2D bien alineadas a través de una cóclea completa para una reconstrucción digital completa de los tejidos cocleares. Dado que es un método fluorescente, los ligandos y la inmunohistoquímica también se pueden utilizar para identificar estructuras cocleares específicas.

Inicialmente, se utilizó una lente cilíndrica para producir dos láminas de luz gaussianas opuestas, pero produjo artefactos de imágenes de absorción. Debido al trabajo de Keller et ^al.10, la lente cilíndrica fija fue reemplazada por un espejo galvanómetro de escaneo para producir la lámina de luz⁹. Además, dado que el centro de la hoja de luz es el más delgado en la cintura del haz, las imágenes 2D de sTSLIM se producen mediante la recopilación de un compuesto de columnas de datos del eje X a lo ancho de la muestra (Figura 3). Este método fue descrito por primera vez por Buytaert y Dircks¹¹. El software personalizado TSLIM para conducir y recopilar imágenes se desarrolló utilizando un programa gráfico para el control del instrumento. La lámina de luz viaja a través de la muestra e ilumina un plano fluorescente dentro del tejido. Este plano fluorescente se proyecta ortogonalmente a través de la muestra transparente y se recoge mediante un microscopio de disección. Los microposicionadores codificados ópticamente permiten escanear a través de la cintura del haz en el eje X para recopilar una sola imagen 2D compuesta y, posteriormente, el microposicionador del eje Z mueve la muestra a un plano más profundo dentro del tejido para obtener una pila de imágenes 2D seccionadas en serie (Video 1, Figura 4). Se recopila una pila de imágenes traslacionales a través de todo el ancho, grosor y longitud de la cóclea, y no es necesario coser imágenes (Video 2). La pila de imágenes se transfiere a otra computadora y se carga en un programa de renderizado 3D para la reconstrucción y cuantificación 3D. Las pilas de imágenes contienen toda la información digital sobre la morfología de una cóclea a la resolución del microscopio. Sin embargo, si se requiere una resolución más alta, la cóclea intacta puede procesarse aún más mediante métodos histológicos destructivos como la sección de microtomos, el escaneo y la microscopía electrónica de transmisión.

El programa de renderizado 3D se utiliza para segmentar diferentes estructuras cocleares para renderizado 3D y análisis cuantitativo. Para la segmentación, cada estructura en cada imagen 2D de la pila se traza utilizando un color diferente mediante una tableta gráfica y un lápiz (Figura 5). Hasta la fecha, se han segmentado 20 estructuras cocleares diferentes (Figura 6). Después de la segmentación, se puede realizar una variedad de análisis 3D. Por ejemplo, el software de renderizado 3D puede resecar virtualmente la cóclea en cualquier plano a lo largo del centroide de la estructura. El video 3 muestra la sección tangencial al órgano de Corti, que revela las células ciliadas a lo largo de la membrana basilar. Este proceso requiere primero la segmentación manual de la estructura de interés. A continuación, el centroide de la estructura se calcula en función del ajuste de mínimos cuadrados de los puntos spline colocados a lo largo del centro de la estructura desde su base hasta su ápice, lo que permite una aproximación de la longitud de la estructura (Video 4). Un proceso similar llamado esqueletización se puede utilizar para visualizar el ancho radial de la estructura a lo largo de su longitud utilizando un mapa de color (Video 4). El volumen total de cada estructura es calculado por el programa después de la segmentación, pero las distancias relativas también se pueden cuantificar y visualizar con mapas de color en un software de renderizado 3D (Figura 7). Las estructuras segmentadas también se pueden exportar para producir representaciones de modelos de plástico sólido ampliadas (Figura 8). Además, el recuento semiautomático de células también se puede realizar utilizando software de renderizado 3D (Figura 9). La inmunohistoquímica y la unión al ligando se pueden utilizar para teñir estructuras cocleares específicas y estas estructuras pueden aislarse de otras estructuras cocleares para la evaluación morfométrica, como la producción de un citocleograma (Figura 10). La longitud, el ancho, la superficie, el volumen y el número de todas las estructuras cocleares se pueden determinar a partir de los modelos 3D, lo que hace que este enfoque sea ideal para mapear el daño coclear a las deficiencias funcionales. Específicamente, el daño coclear debido al envejecimiento, el trauma inducido por el ruido u otros insultos se pueden mostrar y cuantificar en reconstrucciones cocleares 3D a partir de secciones ópticas 2D. Una vez que una cóclea ha sido digitalizada, existen numerosos algoritmos de imagen que se pueden utilizar para evaluar el daño coclear de cualquier tejido dentro de la cóclea en el registro anatómico a otros tejidos cocleares.