JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunologia e infezioni

Высокопроизводительный метод скрининга интегрин-ингибирующих препаратов на основе проточной цитометрии

Published: February 02, 2024
doi:
10.3791/64401
, , , ,
1Department of Immunology, School of Medicine,UConn Health, 2Center for Molecular Discovery,University of New Mexico Health Sciences Center, 3Comprehensive Cancer Center,University of New Mexico Health Sciences Center, 4Department of Pathology,University of New Mexico Health Sciences Center, 5Autophagy, Inflammation, & Metabolism (AIM) Center,University of New Mexico

Summary

Этот протокол описывает высокопроизводительный скрининговый метод на основе проточной цитометрии для выявления низкомолекулярных препаратов, которые ингибируют активацию β2-интегрина на нейтрофилах человека.

Abstract

Этот протокол направлен на создание метода идентификации низкомолекулярных антагонистов активации β2-интегрина с использованием антител, сообщающих о конформационных изменениях, и высокопроизводительной проточной цитометрии. Этот метод также может служить руководством для других высокопроизводительных методов скрининга на основе антител. β2-интегрины — это лейкоцит-специфические молекулы адгезии, которые имеют решающее значение в иммунных реакциях. Нейтрофилы полагаются на активацию интегрина для выхода из кровотока не только для борьбы с инфекциями, но и для участия во многих воспалительных заболеваниях. Контроль активации β2-интегрина представляет собой жизнеспособный подход к лечению воспалительных заболеваний, ассоциированных с нейтрофилами. В этом протоколе моноклональное антитело mAb24, которое специфически связывается с высокоаффинным головным мозгом β2-интегринов, используется для количественной оценки активации β2-интегрина на изолированных первичных нейтрофилах человека. N-формилметионил-лейцилфенилаланин (fMLP) используется в качестве стимула для активации нейтрофильных β2-интегринов. В данном исследовании был использован высокопроизводительный проточный цитометр, способный автоматически обрабатывать 384-луночные планшетные пробы. Влияние 320 химических веществ на ингибирование β2-интегрина оценивают в течение 3 ч. С помощью этого подхода можно идентифицировать молекулы, которые непосредственно нацелены на β2-интегрины или молекулы-мишени в сигнальном пути активации интегрина, инициируемого рецептором G-белка.

Introduction

Многие воспалительные заболевания характеризуются инфильтрацией нейтрофилов в месте отекаили травмы1. Чтобы проникнуть в эти ткани, нейтрофилы должны завершить каскад рекрутирования нейтрофилов, который включает остановку эндотелия, экстравазацию через стенку сосуда и рекрутирование в ткань2. Циркулирующие нейтрофилы нуждаются в активации β2-интегрина, чтобы завершить этот каскад, особенно для фазы ареста. Таким образом, интегрин-ингибирующие препараты, которые снижают адгезию, экстравазацию и рекрутирование нейтрофилов, могут эффективно лечить воспалительные заболевания 3,4.

β2-интегрины и раньше использовались для лечения воспалительных заболеваний. Для лечения псориаза5 типа было разработано моноклональное антитело Efalizumab, непосредственно нацеленное на интегрин αLβ2. Однако эфализумаб был отменен из-за его летального побочного эффекта – прогрессирующей мультифокальной лейкоэнцефалопатии, возникающей в результате реактивации вируса ЮК 6,7. Новые противовоспалительные препараты на основе интегрина должны учитывать сохранение противоинфекционных функций лейкоцитов для минимизации побочных эффектов. Побочные эффекты эфализумаба могут быть связаны с длительной циркуляцией моноклональных антител в кровотоке, которые могут подавлять иммунные функции в долгосрочной перспективе8. Недавнее исследование показывает, что эфализумаб опосредует сшивание αLβ2 и нежелательную интернализацию интегринов α4, обеспечивая альтернативное объяснениепобочных эффектов. Таким образом, короткоживущие низкомолекулярные антагонисты могут избежать этой проблемы.

Представлен высокопроизводительный метод скрининга низкомолекулярных антагонистов β2-интегрина с использованием нейтрофилов человека. Активация β2-интегрина требует конформационных изменений эктодомена интегрина, чтобы получить доступ к лиганду и увеличить его сродство к связыванию. В канонической модели выкидного ножа изогнуто-замкнутый эктодомен интегрина сначала расширяется до расширенно-замкнутой конформации, а затем открывает свой головной состав до полностью активированной расширенно-открытой конформации10,11,12,13. Существует также альтернативный путь, который начинается от согнутого-закрытого к согнутому-открытому и расширенному-открытому, в конечном итоге 14,15,16,17,18,19. Конформационно-специфическое антитело mAb24 связывается с эпитопом в β2-I-подобном домене человека, когда головной убор эктодомена открыт20,21,22,23.

Здесь mAb24-APC используется для определения того, активированы ли интегрины β2. Для активации нейтрофилов и интегрина в качестве стимула в этом протоколе используется N-формилметионил-лейцил-фенилаланин (fMLP), короткий хемотаксический пептид бактериального происхождения, который может активировать нейтрофилы β2 интегрины24. Когда fMLP связывается с Fpr1 на нейтрофилах, активируются нисходящие сигнальные каскады, включающие G-белки, фосфолипазу Cβ и фосфоинозитид-3-киназную γ. Эти сигнальные события в конечном итоге приводят к активации интегрина через сигнальный путь18,25. Помимо низкомолекулярных антагонистов, которые непосредственно связываются с β2-интегринами и предотвращают конформационные изменения активации интегрина26, с помощью этого метода также могут быть обнаружены соединения, которые могут ингибировать компоненты сигнального пути активации β2-интегрина изнутри-наружу. Автоматизированные проточные цитометры обеспечивают высокопроизводительный скрининг. Идентификация новых антагонистов может не только углубить наше понимание физиологии интегрина, но и дать трансляционное представление о противовоспалительной терапии на основе интегрина.

Protocol

Гепаринизированные образцы цельной крови были получены от обезличенных здоровых доноров после получения информированного согласия, одобренного Институциональным наблюдательным советом UConn Health в соответствии с принципами Хельсинкской декларации. Информированное согласие было полу…

Representative Results

Данные репрезентативного скрининга 384-луночных планшетов (рис. 4) показали, что отрицательный контроль имел MFI mAb24-APC 3236 ± 110, в то время как положительный контроль имел MFI mAb24-APC 7588 ± 858. Z’-фактор для этой пластины составляет приблизительно 0,33, что находится в допустимом диапа?…

Discussion

Начало и окончание стимуляции и окрашивания нейтрофилов определяется добавлением нейтрофилов и фиксирующего ПФА. Поэтому очень важно обеспечить одинаковый интервал времени между пипетированием нейтрофилов или PFA в каждую колонку. Это гарантирует, что время стимуляции и окрашивания ?…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарим д-ра Эвана Джеллисона (Evan Jellison) и г-жу Ли Чжу (Li Zhu) из центра проточной цитометрии в UConn Health за помощь в проведении проточной цитометрии, д-ра Линн Паддингтон (Lynn Puddington) из отделения иммунологии UConn Health за поддержку инструментов, г-жу Славу Гаевскую и д-ра Пола Эпплтона (Paul Appleton) из центра клинических исследований UConn Health за их помощь в получении образцов крови. Выражаем благодарность д-ру Кристоферу «Киту» Бонину и д-ру Женеве Харгис из Медицинской школы Калифорнийского университета в Конне за помощь в написании и редактировании этой рукописи. Это исследование было поддержано грантами Национальных институтов здравоохранения, Национального института сердца, легких и крови (R01HL145454), Национального института общих медицинских наук (P20GM121176), США, премией за развитие карьеры от Американской кардиологической ассоциации (18CDA34110426) и фондом стартапов от UConn Health. Рисунок 1 был создан с помощью BioRender.com.

Materials

16-channel pipettes Thermo 4661090N Instrument
384-well plate Greiner 784201 Materials
APC anti-human CD11a/CD18 (LFA-1) Antibody Clone: m24 BioLegend 363410 Reagents
Bravo Automated Liquid Handling Platform  Agilent 16050-102 384 multi-channel liquid handler
Centrifuge Eppendorf Model 5810R Instrument
FlowJo Becton, Dickinson & Company NA Software
Human Serum Albumin Solution (25%) GeminiBio 800-120 Reagents
Lifitegrast Thermofisher  50-208-2121 Reagents
Nexinhib20 Tocris 6089 Reagents
N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP) Sigma F3506 Reagents
Paraformaldehyde 16% solution Electron Microscopy Sciences 15710 Reagents
Plate buckets Eppendorf UL155 Accessory
Plate shaker  Fisher 88-861-023 Instrument
PolymorphPrep PROGEN 1895 (previous 1114683) Reagents
Prestwick Chemical Library Compound Plates (10 mM) Prestwick Chemical Libraries Ver19_384 1520 small molecules, 98% marketed approved drugs (FDA, EMA, JAN, and other agencies approved)
RPMI 1640 Medium, no phenol red Gibco 11-835-030 Reagents
Swing-bucket rotor  Eppendorf A-4-62 Rotor
ZE5 Cell Analyzer Bio-Rad Laboratories Model ZE5 Instrument
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Herrero-Cervera, A., Soehnlein, O., Kenne, E. Neutrophils in chronic inflammatory diseases. Cellular & Molecular Immunology. 19 (2), 177-191 (2022).
  2. Sadik, C. D., Kim, N. D., Luster, A. D. Neutrophils cascading their way to inflammation. Trends in immunology. 32 (10), 452-460 (2011).
  3. Mitroulis, I. et al. Leukocyte integrins: Role in leukocyte recruitment and as therapeutic targets in inflammatory disease. Pharmacology & Therapeutics. 147, 123-135 (2015).
  4. Slack, R. J., Macdonald, S. J. F., Roper, J. A., Jenkins, R. G., Hatley, R. J. D. Emerging therapeutic opportunities for integrin inhibitors. Nature Reviews Drug Discovery. 21 (1), 60-78 (2022).
  5. Frampton, J. E., Plosker, G. L. Efalizumab. American Journal of Clinical Dermatology. 10 (1), 51-72 (2009).
  6. Talamonti, M. et al. Efalizumab. Expert Opinion on Drug Safety. 10 (2), 239-251 (2011).
  7. Saribaş, A. S., Özdemir, A., Lam, C., Safak, M. JC virus-induced progressive multifocal leukoencephalopathy. Future Virology. 5 (3), 313-323 (2010).
  8. Chames, P., Van Regenmortel, M., Weiss, E., Baty, D. Therapeutic antibodies: successes, limitations and hopes for the future. British Journal of Pharmacology. 157 (2), 220-233 (2009).
  9. Mancuso, R. V., Casper, J., Schmidt, A. G., Krähenbühl, S., Weitz-Schmidt, G. Anti-αLβ2 antibodies reveal novel endocytotic cross-modulatory functionality. British Journal of Pharmacology. 177 (12), 2696-2711 (2020).
  10. Anderson, J. M., Li, J., Springer, T. A. Regulation of integrin α5β1 conformational states and intrinsic affinities by metal ions and the ADMIDAS. Molecular Biology of the Cell. 33 (6), ar56 (2022).
  11. Jensen, R. K. et al. Complement receptor 3 forms a compact high-affinity complex with iC3b. The Journal of Immunology. 206 (12), 3032-3042 (2021).
  12. Li, J., Yan, J., Springer, T. A. Low affinity integrin states have faster ligand binding kinetics than the high affinity state. Elife. 10, e73359 (2021).
  13. Luo, B. H., Carman, C. V., Springer, T. A. Structural basis of integrin regulation and signaling. Annual Review of Immunology. 25, 619-647 (2007).
  14. Fan, Z. et al. Neutrophil recruitment limited by high-affinity bent β2 integrin binding ligand in cis. Nature communications. 7 (1), 1-14 (2016).
  15. Fan, Z. et al. High-affinity bent β2-integrin molecules in arresting neutrophils face each other through binding to ICAMs in cis. Cell reports. 26 (1), 119-130 (2019).
  16. Gupta, V. et al. The β-tail domain (βTD) regulates physiologic ligand binding to integrin CD11b/CD18. Blood. 109 (8), 3513-3520 (2006).
  17. Sen, M., Yuki, K., Springer, T. A. An internal ligand-bound, metastable state of a leukocyte integrin, αXβ2. Journal of Cell Biology. 203 (4), 629-642 (2013).
  18. Sun, H., Hu, L., Fan, Z. β2 integrin activation and signal transduction in leukocyte recruitment. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 321 (2), C308-C316 (2021).
  19. Sun, H., Zhi, K., Hu, L., Fan, Z. The activation and regulation of β2 integrins in phagocytes. Frontiers in Immunology. 12, 978 (2021).
  20. Kamata, T. et al. The role of the CPNKEKEC sequence in the β2 subunit I domain in regulation of integrin αLβ2 (LFA-1). The Journal of Immunology. 168 (5), 2296-2301 (2002).
  21. Lu, C., Shimaoka, M., Zang, Q., Takagi, J., Springer, T. A. Locking in alternate conformations of the integrin αLβ2 I domain with disulfide bonds reveals functional relationships among integrin domains. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (5), 2393-2398 (2001).
  22. Yang, W., Shimaoka, M., Chen, J., Springer, T. A. Activation of integrin β-subunit I-like domains by one-turn C-terminal α-helix deletions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (8), 2333-2338 (2004).
  23. Dransfield, I., Hogg, N. Regulated expression of Mg2+ binding epitope on leukocyte integrin alpha subunits. The EMBO Journal. 8 (12), 3759-3765 (1989).
  24. Torres, M., Hall, F., O'neill, K. Stimulation of human neutrophils with formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine induces tyrosine phosphorylation and activation of two distinct mitogen-activated protein-kinases. The Journal of Immunology. 150 (4), 1563-1577 (1993).
  25. Dorward, D. A. et al. The role of formylated peptides and formyl peptide receptor 1 in governing neutrophil function during acute inflammation. The American Journal of Pathology. 185 (5), 1172-1184 (2015).
  26. Lin, F. Y. et al. A general chemical principle for creating closure-stabilizing integrin inhibitors. Cell. 185 (19), 3533-3550 (2022).
  27. Lizcano, A. et al. Erythrocyte sialoglycoproteins engage Siglec-9 on neutrophils to suppress activation. Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 129 (23), 3100-3110 (2017).
  28. Tadema, H., Abdulahad, W. H., Stegeman, C. A., Kallenberg, C. G., Heeringa, P. Increased expression of Toll-like receptors by monocytes and natural killer cells in ANCA-associated vasculitis. PloS One. 6 (9), e24315 (2011).
  29. Nagelkerke, S. Q., aan de Kerk, D. J., Jansen, M. H., van den Berg, T. K., Kuijpers, T. W. Failure to detect functional neutrophil B helper cells in the human spleen. PloS one. 9 (2), e88377 (2014).
  30. Blanco-Camarillo, C., Alemán, O. R., Rosales, C. Low-density neutrophils in healthy individuals display a mature primed phenotype. Frontiers in Immunology. 12, 672520 (2021).
  31. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of biomolecular screening. 4 (2), 67-73 (1999).
  32. Shimaoka, M., Salas, A., Yang, W., Weitz-Schmidt, G., Springer, T.A. Small molecule integrin antagonists that bind to the β2 subunit I-like domain and activate signals in one direction and block them in the other. Immunity. 19 (3), 391-402 (2003).
  33. Liu, W. et al. Nexinhib20 Inhibits neutrophil adhesion and β2 integrin activation by antagonizing Rac-1-Guanosine 5′-Triphosphate interaction. The Journal of Immunology. 209 (8), 1574-1585 (2022).
  34. Robinson, M. et al. Antibody against the Leu-CAM beta-chain (CD18) promotes both LFA-1-and CR3-dependent adhesion events. The Journal of Immunology. 148 (4), 1080-1085 (1992).
  35. Lu, C., Ferzly, M., Takagi, J., Springer, T. A. Epitope mapping of antibodies to the C-terminal region of the integrin β2 subunit reveals regions that become exposed upon receptor activation. The Journal of Immunology. 166 (9), 5629-5637 (2001).
  36. Mauler, M. et al. Platelet serotonin aggravates myocardial ischemia/reperfusion injury via neutrophil degranulation. circulation. 139 (7), 918-931 (2019).
  37. Shen, X. F., Cao, K., Jiang, J., Guan, W. X., Du, J. F. Neutrophil dysregulation during sepsis: an overview and update. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 21 (9), 1687-1697 (2017).
  38. Chiang, C. C., Cheng, W. J., Korinek, M., Lin, C. Y., Hwang, T. L. Neutrophils in Psoriasis. Frontiers in Immunology. 10, 02376 (2019).
  39. Lood, C. et al. Neutrophil extracellular traps enriched in oxidized mitochondrial DNA are interferogenic and contribute to lupus-like disease. Nature medicine. 22 (2), 146-153 (2016).
  40. Bazzoni, G., Shih, D. T., Buck, C. A., Hemler, M. E. Monoclonal antibody 9EG7 defines a novel β1 integrin epitope induced by soluble ligand and manganese, but inhibited by calcium. Journal of Biological Chemistry. 270 (43), 25570-25577 (1995).
  41. Luque, A. et al. Activated conformations of very late activation integrins detected by a group of antibodies (HUTS) specific for a novel regulatory region(355-425) of the common β1 chain. Journal of Biological Chemistry. 271 (19), 11067-11075 (1996).
  42. Mould, A. P., Akiyama, S. K., Humphries, M. J. The inhibitory Anti-β1 integrin monoclonal antibody 13 recognizes an epitope that is attenuated by ligand occupancy: evidence for allosteric inhibition of integrin function. Journal of Biological Chemistry. 271 (34), 20365-20374 (1996).
  43. Spiess, M. et al. Active and inactive β1 integrins segregate into distinct nanoclusters in focal adhesions. Journal of Cell Biology. 217 (6), 1929-1940 (2018).
  44. Yang, S. et al. Relating conformation to function in integrin α5β1. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (27), E3872-E3881 (2016).
  45. Shattil, S. J., Hoxie, J. A., Cunningham, M., Brass, L. F. Changes in the platelet membrane glycoprotein IIb.IIIa complex during platelet activation. Journal of Biological Chemistry. 260 (20), 11107-11114 (1985).
  46. Shattil, S. J., Motulsky, H. J , Insel, P. A., Flaherty, L., Brass, L. F. Expression of fibrinogen receptors during activation and subsequent desensitization of human platelets by epinephrine. Blood. 68 (6), 1224-1231 (1986).
  47. Carreño, R. et al. 2E8 binds to the high affinity i-domain in a metal ion-dependent manner: a second generation monoclonal antibody selectively targeting activated LFA-1. Journal of Biological Chemistry. 285 (43), 32860-32868 (2010).
  48. Keizer, G. D., Visser, W., Vliem, M., Figdor, C. G. A monoclonal antibody (NKI-L16) directed against a unique epitope on the alpha-chain of human leukocyte function-associated antigen 1 induces homotypic cell-cell interactions. The Journal of Immunology. 140 (5), 1393-1400 (1988).
  49. Lefort, C. T. et al. Distinct roles for talin-1 and kindlin-3 in LFA-1 extension and affinity regulation. Blood. 119 (18), 4275-4282 (2012).
  50. van Kooyk, Y. et al. Activation of LFA-1 through a Ca2(+)-dependent epitope stimulates lymphocyte adhesion. Journal of Cell Biology. 112 (2), 345-354 (1991).
  51. Mould, A. P. et al. Conformational changes in the integrin a domain provide a mechanism for signal transduction via hybrid domain movement. Journal of Biological Chemistry. 278 (19), 17028-17035 (2003).
  52. Chigaev, A. et al. Real-time analysis of conformation-sensitive antibody binding provides new insights into integrin conformational regulation. Journal of Biological Chemistry. 284 (21), 14337-14346 (2009).
  53. Njus, B. H. et al. Conformational mAb as a tool for integrin ligand discovery. Assay and Drug Development Technologies. 7 (5), 507-515 (2009).
  54. Chigaev, A., Wu, Y., Williams, D. B., Smagley, Y., Sklar, L. A. Discovery of very late antigen-4 (VLA-4, α4β1 integrin) allosteric antagonists. Journal of Biological Chemistry. 286 (7), 5455-5463 (2011).
  55. Ghigo, A., De Santi, C., Hart, M., Mitash, N., Swiatecka-Urban, A. Cell signaling and regulation of CFTR expression in cystic fibrosis cells in the era of high efficiency modulator therapy. Journal of Cystic Fibrosis. 22, S12-S16 (2023).
  56. Van Goor, F., Yu, H., Burton, B., Hoffman, B.J. Effect of ivacaftor on CFTR forms with missense mutations associated with defects in protein processing or function. Journal of Cystic Fibrosis. 13 (1), 29-36 (2014).

Tags

Flow CytometryHigh-throughput ScreeningIntegrin InhibitorBeta-2 IntegrinNeutrophilAnti-inflammatoryConformational Change AntibodyFMLPGPCR

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Cao, Z., Garcia, M. J., Sklar, L. A., Wandinger-Ness, A., Fan, Z. A Flow Cytometry-Based High-Throughput Technique for Screening Integrin-Inhibitory Drugs. J. Vis. Exp. (204), e64401, doi:10.3791/64401 (2024).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image