JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Medicina

قياسات تشبه إمكانات العمل المستحثة بالليزر لخلايا عضلة القلب على صفائف الأقطاب الكهربائية الدقيقة لزيادة التنبؤ بعلم الأدوية الآمن

Published: September 13, 2022
doi:
10.3791/64355

Summary

يسمح الجمع بين التنقيب بالليزر ومصفوفات الأقطاب الدقيقة (MEA) بتسجيلات تشبه إمكانات الفعل لخلايا عضلة القلب الأولية والمشتقة من الخلايا الجذعية المزروعة. يوفر شكل الشكل الموجي رؤية فائقة لطريقة عمل مركبات الاختبار مقارنة بالتسجيلات القياسية. وهو يربط بين مشبك التصحيح وقراءات MEA لزيادة تحسين أبحاث سلامة القلب في المستقبل.

Abstract

غالبا ما يسبق عدم انتظام ضربات القلب الناجم عن الأدوية التي تهدد الحياة إمكانات عمل القلب المطولة (AP) ، مصحوبة عادة بتقلبات محتملة صغيرة في غشاء اضطراب النظم العصبي. يمكن أن يكون شكل ومسار الوقت لجزء إعادة الاستقطاب من AP محوريا لوجود أو عدم وجود عدم انتظام ضربات القلب.

تتيح صفائف الأقطاب الكهربائية الدقيقة (MEA) سهولة الوصول إلى التأثيرات المركبة السمية للقلب عبر إمكانات المجال خارج الخلية (FP). على الرغم من أنها أداة قوية وراسخة في البحث وعلم الأدوية لسلامة القلب ، إلا أن شكل موجة FP لا يسمح باستنتاج شكل AP الأصلي بسبب مبدأ التسجيل خارج الخلية وتصفية التيار المتردد الجوهري (AC) الناتجة.

يمكن لجهاز جديد ، موصوف هنا ، أن يفتح بشكل متكرر غشاء خلايا عضلة القلب المزروعة فوق أقطاب MEA في نقاط زمنية متعددة للزراعة ، باستخدام شعاع ليزر نانوثانية عالي التركيز. ينتج عن التنقيب بالليزر تحويل الإشارة الكهربية من FP إلى APs الشبيهة داخل الخلايا (AP المستحثة بالليزر ، liAP) وتمكن من تسجيل انحرافات الجهد عبر الخلايا. يسمح هذا الوصول داخل الخلايا بوصف أفضل لشكل AP وتصنيف أفضل وأكثر حساسية لإمكانات اضطراب النظم من تسجيلات MEA العادية. يعد هذا النظام امتدادا ثوريا للطرق الفيزيولوجية الكهربية الحالية ، مما يسمح بالتقييم الدقيق للتأثير السمي للقلب مع جميع مزايا التسجيلات القائمة على MEA (التجارب السهلة والحادة والمزمنة ، وتحليل انتشار الإشارة ، وما إلى ذلك).

Introduction

تنتج المساهمة الكهربائية لنبضات القلب عن تفاعل معقد ومحدد التوقيت بدقة للعديد من قنوات القلب والناقلات ، بالإضافة إلى الانتشار المضبوط بدقة للإشارات الكهربائية عبر عضلة القلب1. يمكن أن يؤدي تغيير هذه الآليات المنسقة بشكل وثيق (على سبيل المثال ، تعاطي المخدرات) إلى عواقب وخيمة على وظيفة القلب (أي عدم انتظام ضربات القلب الذي يهدد الحياة)2,3. يعرف عدم انتظام ضربات القلب بأنه عدم انتظام ضربات القلب التي تغير الإيقاع الطبيعي للقلب ، والتي يمكن أن يكون لها عواقب تهدد الحياة. قد تكون ناجمة إما عن ضعف بدء موجة من الإثارة القلبية أو عن طريق الانتشار غير الطبيعي لإثارة القلب4 ، مما يؤدي بدوره إلى خلل في آلية ضخ القلب.

يجب استبعاد العديد من الأدوية المرشحة القوية للغاية من إجراء مزيد من التحقيقات خلال مرحلة تطوير الدواء المبكرة بسبب إمكاناتها (المؤيدة) لعدم انتظام ضربات القلب 2,3. يقومون بتعديل القنوات القلبية الرئيسية (على سبيل المثال ، القناة الجينية البشرية المرتبطة بالأثير [hERG]) المسؤولة عن تكوين وإنهاء إمكانات عمل القلب الطبيعي بالإضافة إلى انتشار الإشارة اللاحقة5.

تستخدم شركات الأدوية بشكل روتيني قياسات المشبك أو صفائف الأقطاب الكهربائية الدقيقة (MEA) للتحقيق في التأثيرات المحتملة للسمية القلبية خارج الهدف التي يسببها الأدوية المرشحة. تسمح تسجيلات Patch-clamp بفك تأثير المواد على قنوات أيون القلب وتحليل إمكانات عمل القلب عبر الخلايا بدقة مكانية وزمانية عالية 6,7. ومع ذلك ، تشمل عيوب هذه التقنية إنتاجية منخفضة مع مشبك تصحيح يدوي وقابلية محدودة للتطبيق للأتمتة بسبب اعتماد هذه الطريقة على الخلايا في التعليق. علاوة على ذلك ، لا يمكن التحقيق في الآثار المزمنة بسبب غزو الطريقة. أخيرا ، عادة ما تتم دراسة الخلايا المفردة فقط في وقت واحد بدلا من المخلوي القلبي بأكمله ، مما يجعل من المستحيل معالجة المعلومات حول انتشار الإشارة.

تعتبر الأصباغ الحساسة للجهد ذات قيمة للتحقيق غير الجراحي في إمكانات عمل القلب وعدم انتظام ضربات القلب الناجم عن الأدوية8. أنها تسمح بالتحقيق في كل من نشاط الخلية الواحدة والمخلوي. عيوب هذه الطريقة هي التأثيرات السامة للخلايا إما للأصباغ في حد ذاتها أو لمنتج التفاعل أثناء الإضاءة. يتم استخدامها للتجارب الحادة ولا تكاد تنطبق على الدراسات طويلة الأجل9،10،11. حققت البروتينات الحساسة للجهد كبدائل تقدما كبيرا على مدى العامين الماضيين من حيث قابلية الاستخدام والحساسية ولكنها تتطلب تعديلا وراثيا للخلايا ذات الاهتمام وتفتقر إلى الدقة الزمنية العالية مقارنة بالتقنيات الفيزيولوجية الكهربية12.

تشير المعلومات المستقاة من أحدث مبادرة CiPA13 إلى أن MEAs تستخدم على نطاق واسع في فحوصات سلامة القلب كنهج فسيولوجي كهربي بديل لأنها تمثل أداة قوية وراسخة للتحقيق في وظائف القلب وعلم الأدوية الآمن. تزرع الخلايا العضلية القلبية كخلية مخلوية مباشرة فوق الرقائق ، ويتم تسجيل إمكانات المجال خارج الخلية (FPs) بشكل غير جراحي عبر أقطاب كهربائية دقيقة مدمجة بالركيزة. يسمح مبدأ التسجيل هذا بإجراء فحوصات إنتاجية متزايدة على مدار عدة أيام ، مما يجعلها مناسبة للبحوث الصيدلانية حول التأثيرات المزمنة. شكل موجة FP الناتج هو مشتق من AP14 داخل الخلايا. يمكن الوصول بسهولة إلى معلمات مثل معدل النبض وسعة الجزء الأولي من FP ومدة FP15. لا يمكن الوصول إلى المعايير الأساسية الأخرى مثل التمييز بين إطالة وتثليث FP (علامة مهمة لاضطراب نظم القلب16,17) بسبب تأثير ترشيح التيار المتردد لهذه التقنية. علاوة على ذلك ، غالبا ما يتم التغاضي بسهولة عن اكتشاف الأحداث الصغيرة الأخرى التي تعاني من اضطراب النظم مثل عمليات إزالة الاستقطاب المبكرة والمتأخرة (EAD و DAD ، على التوالي) بسبب سعتها الصغيرة.

هنا نصف طريقة للوصول إلى إمكانات الغشاء داخل الخلايا عن طريق فتح غشاء خلايا عضلة القلب. يسمح جهاز IntraCell (المشار إليه فيما يلي باسم جهاز التسجيل داخل الخلايا) بفتحات غشائية متكررة لخلايا عضلة القلب المزروعة فوق أقطاب MEA باستخدام شعاع ليزر نانوثانية عالي التركيز عبر ظاهرة فيزيائية محددة (رنين البلازمون السطحي)18. نتيجة لذلك ، ينتقل التسجيل من FP العادي إلى AP الشبيه داخل الخلايا (AP الناجم عن الليزر ، liAP). يوضح البروتوكول كيف يسمح ذلك بالوصول إلى الجوانب الحركية لشكل الموجة التي لا يمكن التقاطها بسهولة من خلال تحليل FPS. تمثل هذه الطريقة جسرا بين مشبك التصحيح التقليدي داخل الخلايا وتسجيلات MEA. وبالتالي فإن هذه التقنية هي امتداد قوي لطرق تقييم سلامة القلب الحالية.

Protocol

1. إعداد خلايا عضلة القلب المستحثة المشتقة من الخلايا الجذعية ملاحظة: تم تحضير الخلايا العضلية القلبيةiCell 2 (المشار إليها باسم الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات [iPSCs]) وفقا للبروتوكول المقدم من المورد. سيتم تلخيص البروتوكول بإيجاز في القسم التالي. قم بإذابة الطلاء ووسط الصيانة عند 4 درجات مئوية لمدة 24 ساعة قبل الاستخدام. تحضير طلاء الفبرونيكتين عن طريق إذابة الفبرونيكتين المعقم في ماء معقم بتركيز 1 مجم / مل. قم بتجميد تخزين هذا المخزون في حصص (على سبيل المثال ، 25 ميكرولتر لكل قسمة علي). قم بتخفيف محلول المخزون المقتبس 1:20 في محلول الملح المتوازن المعقم من Dulbecco (dPBS). قم بتغطية حقول القطب الكهربائي ل MEAs المعقمة سابقا تحت غطاء التدفق الصفحي ، من حيث القطرة في ظل ظروف معقمة باستخدام الفبرونيكتين باستخدام ماصة 10 ميكرولتر. لهذا ، قم بإسقاط 5 ميكرولتر من محلول طلاء الفبرونيكتين على حقول القطب ولاحظ تكوين قطرة أعلى منطقة القطب. تأكد من عدم لمس الأقطاب الكهربائية الحساسة.ملاحظة: للحفاظ على ظروف معقمة ، انقل شريحة MEA إلى طبق بتري معقم قبل إزالتها من غطاء التدفق الرقائقي. احتضان MEAs المغلفة لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية في حاضنة يفضل. قم بإذابة الكريوفيال الذي يحتوي على خلايا عضلة القلب في حمام مائي عند حوالي 37 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة حتى يتبقى القليل من بلورة الثلج. انقل محلول الخلية برفق إلى أنبوب سعة 50 مل. أضف 1 مل من وسط الطلاء إلى المبردة الفارغة. انقل المحلول بالتنقيط خلال فترة زمنية مدتها 90 ثانية إلى الأنبوب سعة 50 مل لتقليل الصدمة التناضحية. أضف برفق 8 مل إضافية من وسط الطلاء في الأنبوب. امزج معلق الخلية بعناية باستخدام ماصة سعة 10 مل. احسب العدد الإجمالي للخلايا القابلة للحياة باستخدام القياس الخلوي الفلوري الآلي. يجب أن يكون الرقم قريبا من الرقم الموجود في ورقة البيانات المقدمة من الشركة المصنعة. قم بتدوير محلول الخلية لأسفل لمدة 3 دقائق عند 200 × جم في درجة حرارة الغرفة. قم بإزالة المادة الطافية عن طريق الشفط باستخدام ماصة زجاجية متصلة بنظام ضخ. اضبط رقم الخلية بين 6000 و 15000 خلية قابلة للحياة / ميكرولتر.ملاحظة: عادة ما يكون عدد الخلايا في النطاق المذكور أعلاه ولكن يمكن أن يختلف حسب المورد المعني. قم بإزالة محلول الطلاء الذي تم تطبيقه في الخطوة 1.3 من منطقة القطب الكهربي MEA باستخدام ماصة 10 ميكرولتر مباشرة قبل بذر الخلية. بذر الخلايا مباشرة بعد الإزالة لتجنب تجفيف الطلاء. لهذا ، قم بزرع الخلايا بالتنقيط عند 4 ميكرولتر لكل من MEAs ذات 6 آبار و 1 بئر MEAs على حقول القطب بنفس الطريقة التي يتم بها مع الطلاء. اسمح للخلايا بالالتصاق لمدة 1 ساعة في الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 قبل ملء الآبار بوسط طلاء معقم يتم تسخينه إلى حوالي 37 درجة مئوية عند 200 ميكرولتر ل 6 بئر MEA و 1 مل لبئر واحد MEA تحت غطاء التدفق الصفحي. قم بإجراء تغيير متوسط كامل بعد 48 ساعة من الطلاء تحت غطاء التدفق الرقائقي. لهذا ، قم بإزالة وسط الطلاء عن طريق الشفط باستخدام ماصة زجاجية متصلة بنظام ضخ. ثم أضف 200 ميكرولتر من وسط الصيانة المعقم المسخن إلى 37 درجة مئوية إلى الآبار. قم بإجراء تغييرات متوسطة كاملة كل يوم. ابدأ في قياس الخلايا بعد 5-8 أيام من ذوبان الجليد. قم بإجراء تغيير متوسط كامل قبل 2 ساعة من بدء التجارب. 2. تسجيلات MEA ملاحظة: يتكون الجهاز المستخدم لتحويل إشارة FP إلى liAP من مجهر عمودي وليزر 1064 نانومتر. ضع نظام MEA أعلى الجهاز مع توسيط حامل شريحة MEA فوق فتحة الهدف. ضع MEA الذي تم إعداده بحيث يكون الهدف مباشرة تحت فتحة نظام MEA للسماح لليزر بالتركيز على الأقطاب الكهربائية. انقل شريحة MEA مع الخلايا المزروعة من الحاضنة إلى إعداد MEA قبل 15 دقيقة من التسجيل ، مما يسمح للخلايا بالتعافي من الاضطراب الميكانيكي. نظف وسادات ودبابيس التلامس بعناية باستخدام الأيزوبروبانول وقطعة قطن لتقليل مستويات الضوضاء. ضع MEA بعناية في إعداد MEA. ضع شريحة MEA مع الشعار في الأسفل أعلى الجانب الأيسر (6 آبار MEA) أو مع القطب المرجعي إلى اليسار (MEA أحادي البئر). اضبط التدفئة المدمجة بنظام MEA على 38 درجة مئوية. ضع حجرة صغيرة فوق شريحة MEA لتخلل الخلايا باستمرار بالكاربوجين المرطب (5٪ CO 2 و 95٪ O2) لإعادة تهيئة ظروف الحاضنة ومنع التبخر. أغلق غطاء الجهاز. يسمح مفتاح الأمان المدمج فقط بتنشيط الليزر إذا كان الغطاء مغلقا فوق شريحة MEA. اضبط مرشح نظام MEA باستخدام برنامج تكوين MEA على 0.1 هرتز أو أقل من الترددات العالية و 3500 هرتز للترددات المنخفضة. استخدم برنامج MC_Rack (برنامج التسجيل) أو أي برنامج بديل للتسجيل. اضبط نطاق الإدخال وفقا لاحتياجاتك لضمان عدم تشبع الإشارة بمكبر الصوت ومعدل أخذ العينات (على سبيل المثال ، 20 كيلو هرتز). استخدم وظيفة العرض طويلة المدى للبرنامج للتحقق من التسجيل. 3. تثقيب الخلايا المستحثة بالليزر بعد إدخال شريحة MEA في إعداد MEA وإعداد البرنامج ، قم بتهيئة ميكانيكا الليزر باستخدام برنامج FB Alps (برنامج التهيئة). أولا ، انقر فوق الزر “تهيئة “. في نهاية التهيئة ، ستكون نقطة الليزر الافتراضية في البئر D ل 6-well-MEA وفي أسفل اليسار ل MEA بئر واحد ، على التوالي. حرك نقطة الليزر الافتراضية باستخدام Ctrl + النقر بالماوس في منتصف القطب D5 واضبط التركيز. اضبط التركيز عن طريق Ctrl + التمرير باستخدام عجلة الماوس. اضغط على الزر تعيين P1. ستنتقل نقطة الليزر الافتراضية تلقائيا إلى البئر F. كرر العملية باستخدام القطب F5 وحدد Set P2. بعد هذا الإجراء ، ستنتقل نقطة الليزر إلى البئر B. كرر نفس العملية مع القطب B5 واضغط على Set P3 في البرنامج. النظام محاذ الآن. اضبط طاقة الليزر ووقت المعالجة وفقا لاحتياجات خلاياك. هنا ، تم استخدام 40٪ من الطاقة و 25٪ من وقت المعالجة. لتمكين الليزر ، انقر فوق الزر Laser Off ، والذي سيظهر بعد ذلك على شكل ليزر. قم بالتبديل إلى برنامج التسجيل ، واختر اسم ملف ، وانقر فوق الزر “تسجيل أحمر ” متبوعا بزر التشغيل أعلى النافذة لتسجيل القياس. سجل خط أساس 60 ثانية قبل فتح الخلايا بالليزر. عد إلى برنامج التهيئة. قم بإلغاء تنشيط الأقطاب الكهربائية ليتم استبعادها بواسطة الليزر على الخريطة الافتراضية على الجانب الأيمن باستخدام Ctrl + النقر بالماوس. حدد الأقطاب الكهربائية محل الاهتمام عن طريق تنشيطها على تمثيل الصفيف على الجانب الأيمن من نافذة البرنامج. لبدء تشغيل الليزر ، استخدم Alt + النقر بالماوس وحدد القطب المركزي لهذا البئر. يؤدي هذا إلى بدء الليزر لفتح الخلايا تلقائيا على كل قطب كهربائي من هذا البئر. كرر لكل بئر. سيقوم الليزر بعد ذلك بفتح جميع الأقطاب الكهربائية التي تم تنشيطها مسبقا للبئر المحدد تلقائيا. 4. التعامل مع المخدرات وتطبيقها تحضير جميع المواد لاستخدامها في اختبارات المخدرات طازجة في يوم القياسات. تأكد من أن تركيز التطبيق النهائي أعلى 10 مرات في الوسط لعمل تخفيف 1:10 في الآبار. قم بإذابة نيفيديبين و E4031 و Dofetilide أولا في DMSO بتركيز mM ، ثم في المتوسط إلى 10x من التركيز المطلوب. لا تتجاوز أبدا تركيز DMSO النهائي بنسبة 0.1٪ في البئر. سجل نشاط خط الأساس لمدة 60 ثانية. ابدأ عملية التنقيب المستحثة بالليزر كما هو موضح في الخطوة 3 من البروتوكول ، مما يؤدي إلى تحويل FP إلى شكل liAP. تطبيق جميع الأدوية كتركيز واحد لكل بئر. قم بإزالة 20 ميكرولتر من الوسط لكل بئر ل 6 آبار MEAs و 100 ميكرولتر ل MEAs ذات البئر الواحد ، على التوالي. أضف 20 ميكرولتر أو 100 ميكرولتر ، اعتمادا على نوع MEA ، من محلول مخزون الدواء المراد قياسه إلى البئر وبعناية ماصة لأعلى ولأسفل 2-3 مرات. إجراء ما لا يقل عن ثلاث نسخ متماثلة لكل دواء وتركيز لتحقيق الصلة الإحصائية. اسمح للمركبات بالغسل لمدة 300 ثانية. خلال هذا الوقت ، قد يتحول شكل liAP مرة أخرى إلى شكل FP. مرة أخرى ، حث الثقب الناجم عن الليزر وتسجيل التأثيرات المحتملة التي يسببها المركب على liAP لمدة 60 ثانية إضافية. 5. تصدير البيانات حدد الأقطاب الكهربائية ذات الصلة عن طريق إعادة تشغيل التسجيل في برنامج التسجيل. استخدم MC_DataTool لتحويل ملفات MC_Rack إلى ملفات ASCII .txt. اضغط على ملف > افتح MCD > حدد ملف MC_Rack. انقر على زر txt (نص أزرق). حدد قطب كهربائي. سيتم عرض القطب المحدد في القائمة على الجانب الأيمن. انقر فوق تصفح لتحديد المجلد وتغيير اسم ملف .txt الجديد. انقر فوق حفظ. قم بإلغاء تحديد القطب الذي تم تصديره وحدد القطب التالي المراد تصديره. كرر الإجراء لجميع الأقطاب الكهربائية ذات الأهمية. 6. معالجة البيانات والتحليل الإحصائي استيراد الآثار الثنائية المحولة إلى R19. تصور / تحليل البيانات باستخدام البرامج النصية المصممة خصيصا والتي تحتوي على الحزم التالية: dplyr و tidyr و ggplot220،21،22.

Representative Results

يتكون نظام التسجيل المستخدم لتسجيل النشاط الكهربائي من خلايا عضلة القلب المزروعة من نظام MEA قياسي مجهز بسخان وغرفة للكربوجين متصلة بجهاز كمبيوتر. تم ضبط النظام أعلى جهاز التسجيل داخل الخلايا ، والذي تم تركيبه بدوره فوق وحدة صغيرة مضادة للاهتزاز (الشكل 1A-B). بدأت خلايا عضلة القلب المشتقةمن iPSC 2 في الضرب تلقائيا في غضون 2-3 أيام بعد ذوبان الجليد (أيام في المختبر ، DIV) وكانت مرئية تحت المجهر. من DIV 4 فصاعدا ، أصبح تردد الضرب منتظما ، ويمكن اكتشاف إمكانات المجال خارج الخلية (FP) ذات السعة من الذروة إلى الذروة لمكون إزالة الاستقطاب بين 1 إلى 5 مللي فولت على معظم الأقطاب الكهربائية داخل الآبار المعنية لرقائق MEA. يمكن اكتشاف النشاط الكهربائي في أكثر من 95٪ من الآبار قيد التحقيق. من DIV 7 فصاعدا ، زاد احتمال انفصال الخلية ، مما يجعل من المستحيل استخدام هذه الآبار. يسمح برنامج التحكم في فتحة الغشاء المستحثة بالليزر بضبط كل من الطاقة ووقت المعالجة لليزر الذي يتوسط فتحة غشاء الخلية فقط على القطب قيد التحقيق (الشكل 1C) ، في حين أن الأقطاب الكهربائية الأخرى في البئر المعنية لا تتأثر. في حين أن الإعدادات المحافظة للغاية لم تغير الشكل الموجي ل FP ، إلا أن الإعدادات العالية جدا أدت إلى إصابة مفترضة لخلايا عضلة القلب ، والتي يشار إليها بضرب قوي ولكن عابر أو فقدان الإشارة. عند ضبطه على إعداد 40٪ من الطاقة و 25٪ من وقت المعالجة الذي تتحمله الخلايا جيدا ، أدى تشغيل نبضة الليزر إلى تغييرات متعددة في شكل الموجة المسجل (انظر الشكل 1D للحصول على تسجيل مثالي). في ظل هذه الظروف ، لم يلاحظ أي تغيير في مادة القطب بشكل مجهري. زادت سعة الإشارة المسجلة بشكل كبير بمقدار 4.1 ± 0.41 (ن = 20 ، النطاق 1.34-8.83) مرة ، تم تحليلها من مجموعة فرعية مختارة عشوائيا من التسجيلات ، مما أدى إلى سعة تتراوح بين 7 و 22 مللي فولت. علاوة على ذلك ، تحول شكل الموجة من شكل FP قياسي مع انحراف جهد سريع وثنائي الطور وعابر في البداية ، متبوعا بمرحلة هضبة مرة أخرى عند خط الأساس وانحراف صغير يشير إلى نهاية FP إلى شكل كان أقرب إلى AP مسجل داخل الخلايا مع ارتفاع سريع ومرحلة هضبة ممتدة غير مستقطبة ومرحلة إعادة استقطاب مع أسفل خط الأساس (الشكل 1E ). حددنا انحرافات الجهد هذه على أنها AP المستحثة بالليزر (liAP). في معظم الحالات ، كان الانتقال عابرا ومقلوبا جزئيا على الأقل في غضون 5 دقائق. ظل انتشار الإشارة داخل المخلوي القلبي دون تغيير بعد تحريض liAP (الشكل 2) ، مما يشير إلى أن المخلوي المتبقي لم يتأثر بالضرر المحتمل من نبضة الليزر. سمحت أوجه التشابه مع نقاط الوصول المسجلة داخل الخلايا باستخراج معلمات liAP التي لا يمكن الوصول إليها بواسطة FPs (للاطلاع على المعلمات النموذجية ، انظر على سبيل المثال ، الشكل 3A) ، وأبرزها قياس مدة liAP في نقاط زمنية محددة (على سبيل المثال ، عند 20٪ و 50٪ و 90٪) (الشكل 3B) ، مماثلة ل APD20 / 50/90 المستخدمة بشكل شائع لوصف نقاط الوصول. اختبرنا بعد ذلك استجابة خلايا عضلة القلب المفتوحة بالليزر لمركبات الأدوات الدوائية القلبية شائعة الاستخدام. يمكن العثور على تصميم بروتوكول مثالي في الشكل 3C. نظرا لأن تحويل liAP لم يستمر دائما طوال التجربة بأكملها ، فقد تم تنفيذ التطبيق المركب كتركيز واحد لكل بئر بدلا من طريقة تراكمية لتقليل إجمالي وقت التسجيل. ومع ذلك ، كان من الضروري إما إعادة فتح الخلايا أو فتح منطقة قطب كهربائي آخر قبل تطبيق مركب الاختبار. أدت إضافة مانع قناة Ca 2+ المحدد من النوع L ، Nifedipine23,24 ، إلى تقليل مرحلة الهضبة من liAP بطريقة تعتمد على التركيز وبالتالي تقصير liAP بالكامل (الشكل 4A ، B). كان هذا التقصير مشابها للتحليل الذي تم الحصول عليه من FPs لخلايا عضلة القلب من الأقطاب الكهربائية غير المعالجة (الشكل 4C) ، مما يشير إلى أن طريقة التسجيل هذه لم يكن لها آثار ضارة مقارنة بتسجيلات FP الكلاسيكية. E4031 يمنع إعادة استقطاب قناة البوتاسيوم Kv1.11 (hERG)ذات الصلة 25 ويؤدي إلى سلوك عدم انتظام ضربات القلب في خلايا عضلة القلب بتركيزات متزايدة. على غرار التحليل الذي تم الحصول عليه من تسجيلات FP ، زاد E4031 مدة liAP بطريقة تعتمد على التركيز (الشكل 5). بالإضافة إلى ذلك ، عند تركيزات 0.01 ميكرومتر وأعلى ، كانت انحرافات الجهد الإيجابي الصغيرة في نهاية liAP مرئية. أصبحت هذه الانحرافات أكثر بروزا مع تركيزات أعلى ، مما يشير إلى إزالة استقطاب جديدة عابرة ، على عكس FPs ، حيث كانت هذه الانحرافات غير مرئية تقريبا (انظر الشكل 5B-C ، الآثار العلوية (FP) مقابل الآثار السفلية (liAP)). يعرف هذا السلوك باسم الاستقطاب المبكر (EAD). عند أعلى تركيز يبلغ 0.1 ميكرومتر ، تصاعدت EADs هذه بمرور الوقت إلى نبضات خارج الرحم ، وهي إمكانات عمل سابقة لأوانها (الشكل 5C). يعد كل من EAD والنبضات خارج الرحم من المؤشرات الرئيسية لنشاط اضطراب نظم القلب. في نهاية المثال الموضح في الشكل 5 د، أدى النشاط الكهربي إلى عدم انتظام ضربات القلب. أيضا ، كانت علاقات التركيز والاستجابة المعروضة بين تسجيلات FP و liAP متطابقة (الشكل 5E). ومع ذلك ، هناك تباين أكبر في بيانات FP الناتجة عن عنصر إعادة الاستقطاب الضعيف في FPs عند تركيزات أعلى من مركب الاختبار. يبدو أن الطبيعة المميزة لخلايا عضلة القلبالمشتقة من iPSC 2 تميل إلى توليد APs طويلة بشكل غير فسيولوجي في ظل ظروف التحكم أيضا (مدد AP > 700 مللي ثانية). طبق نظام MEA ترشيحا جوهريا للتيار المتردد 0.1 هرتز ، مما أدى بدوره إلى شكل مرشح جزئيا ل liAP ، على الرغم من عدم حجب المعلومات النوعية حول بداية ونهاية AP الأساسي. اتضح أن الحدوث الأولي لانحرافات الجهد المضطرب يمكن اكتشافه بتركيزات أقل في liAPs مقارنة بتسجيلات FP. يظهر في الشكل 6 تسجيل النشاط الكهربائي أثناء تطبيق Dofetilide بتركيز 3 ميكرومتر. تم الحصول على التسجيل في نفس البئر. على الرغم من أن كلا من FP و liAP عرضوا فترات تقارب 2 ثانية ، إلا أن شكل موجة FP كان غير مزعج ، حيث قدم انحرافات إعادة استقطاب منتظمة. في الوقت نفسه ، في نهاية liAPs ، أصبحت EADs بأحجام مختلفة مرئية. هذه الزيادة في الحساسية الدوائية ذات الصلة تدعم النتيجة القائلة بأن liAPs التي يسببها رنين البلازمون السطحي تسمح بتحسين تأهيل مرحلة إعادة الاستقطاب وبالتالي تساعد على معرفة المزيد عن طريقة عمل مركبات الاختبار قيد التحقيق. الشكل 1: إعداد التسجيل داخل الخلايا والتسجيلات النموذجية . (أ) نظرة عامة على الإعداد. (ب) منظر علوي لنظام التسجيل مع مضخم تسجيل MEA مفتوح. (ج) برنامج التهيئة مع خريطة MEA الافتراضية على الجانب الأيمن. 1: طاولة مضادة للاهتزاز ، 2: نظام تسجيل داخل الخلايا ، 3: غطاء حماية ليزر ، 4: غرفة كربوجين مرطبة ، 5: نظام تسخين MEA ، 6: لوحة واجهة MEA ، شريحة MEA 7: 1 جيدا داخل مضخم التسجيل. د: تسجيل أمثلة من قطب كهربائي واحد قبل وبعد تحريض LiAPs. أعلى: تسجيل حوالي 6 دقائق. تشير الخطوط المنقطة إلى المساحات الموسعة الموضحة في الأسفل. (ه) FP مكبرة (أعلى) و liAP (أسفل). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل. الشكل 2: يظل نمط انتشار الإشارة محفوظا بعد تحريض liAP. ترميز اللون الكاذب لانتشار إشارة موجة الإثارة داخل المخلوي. يشير اللون الأزرق مبكرا (بدءا من -4 مللي ثانية) ؛ يشير اللون الأحمر إلى نقاط الوقت المتأخرة (+3 مللي ثانية) من الإشارة التي تم الحصول عليها عند القطب المرجعي E54 كما هو موضح في شريط الألوان. تنتقل الإشارة من أعلى اليمين إلى أسفل يسار صفيف القطب. (أ) قبل تحريض liAP ، (ب) 1 دقيقة بعد تحريض liAP. (ج) 4 دقائق بعد تحريض liAP. يشير رمز الفلاش إلى نقطة الحث بالليزر عند القطب 64. لاحظ أنه لا يوجد فرق واضح في اتجاه الانتشار العام. تشير المستطيلات السوداء إلى بيانات غير صالحة. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل. الشكل 3: تعريف معلمة FP / liAP وبروتوكول التسجيل . (أ) المعلمات التي يمكن استخراجها من FP الكلاسيكي. (ب) المعلمات الإضافية التي يمكن الحصول عليها من liAPs. (ج) الجدول الزمني لقياس المخدرات. من اليسار إلى اليمين: تسجيل التحكم لمدة 60 ثانية ، تحريض liAP ، تسجيل liAP لمدة 60 ثانية ، تطبيق الدواء ، وقت الغسيل 300 ثانية ، إعادة تحريض liAP ، تسجيل liAP لمدة 60 ثانية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل. الشكل 4: نيفيديبين يقصر liAP القلب بطريقة تعتمد على التركيز. (A) أعلى: آثار FP عند التحكم (أزرق) وفي وجود 0.3 ميكرومتر نيفيديبين (أحمر). يتم عرض الآثار مع إزاحة المحور ص لتحسين التصور. أسفل: آثار liAP من نفس تسجيل MEA ، مما أدى إلى تقصير liAP جنبا إلى جنب مع زيادة في معدل الضرب. (ب) تراكب liAPs مفردة أثناء التحكم (الأزرق) وتطبيق تركيزات مختلفة من نيفيديبين (أحمر). أ: 0.01 ميكرومتر ، ب: 0.1 ميكرومتر ، وج: 0.3 ميكرومتر. لاحظ تقصير مدة liAP مع زيادة التركيزات. (ج) علاقة التركيز والاستجابة لعرض الإشارة التي تم الحصول عليها من تسجيلات FP (أسود) و liAP (أحمر). البيانات من n = 3 تجارب وتطبيعها للتحكم. تشير أشرطة الخطأ إلى الخطأ القياسي للمتوسط. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل. الشكل 5: E4031 يحفز (مؤيد) سلوك عدم انتظام ضربات القلب. (A) FP (أعلى) و liAP (أسفل) في ظروف التحكم. (ب – ج) تم تسجيل FPs و liAPs في نقاط زمنية مختلفة بعد تطبيق E4031 (0.1 ميكرومتر). بعد 80 ثانية ، تظهر EADs الأولى في نهاية liAP (B ؛ مميزة بسهم أحمر). تتحول EADs إلى نبضات خارج الرحم بعد 320 ثانية في وجود مركب الاختبار (C). د: بعد 530 ث، يدخل المخلوي القلبي في حالة تسرع القلب. تتبع مصور من تسجيل liAP. (ه) علاقة التركيز والاستجابة ل FP (أسود) و liAP (أحمر). البيانات من n = 4 تجارب ، تطبيع للتحكم. تشير أشرطة الخطأ إلى الخطأ القياسي للمتوسط. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل. الشكل 6: يعد اكتشاف أحداث اضطراب النظم أكثر حساسية في liAPs من FPs . (أ) تسجيل FP و (B) تسجيل liAP داخل نفس البئر أثناء تطبيق 3 ميكرومتر دوفيتيليد. بينما في نهاية بعض liAPs ، يمكن اكتشاف EADs ، تظل غير قابلة للاكتشاف في تسجيلات FP. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Discussion

توضح هذه الطريقة المبتكرة طريقة جديدة للتحقيق في المختبر في التعديل الدوائي لإمكانات عمل القلب أثناء تطبيق مركبات الأدوات الدوائية القلبية.

تسمح تسجيلات MEA الكلاسيكية بتسجيلات FP ، وهي مشتقة من القلب AP14. يتضمن هذا التسجيل غير المباشر المسار الزمني لإزالة الاستقطاب وإعادة الاستقطاب وبالتالي يزيل الخصائص الأساسية ل AP. علاوة على ذلك ، على الرغم من أن تغير الجهد عبر الخلايا ل AP يصل عادة إلى قيم تبلغ حوالي 100 مللي فولت ، إلا أن السعة الإجمالية ل FP تظل منخفضة نسبيا ، مع سعة ذروة تتراوح بين عدة قيم 100 μV وقيم mV منخفضة من رقم واحد. بسبب مبدأ التسجيل ، تكون مرحلة إعادة الاستقطاب صغيرة ؛ في كثير من الحالات ، يكون مجرد اكتشاف وغالبا ما يكون شكله غير واضح ، مما يجعل من الصعب تحديد نهاية FP. يسمح لنا فتح غشاء الخلية بالوصول إلى الجهد داخل الخلايا ، وبالتالي الكشف عن المسار الزمني ل AP القلبي. هناك مزايا متعددة لطريقة التسجيل هذه مقارنة بتسجيلات FP. أولا ، تكون سعة الإشارة أكثر بروزا ، مما يوفر نسبة إشارة إلى ضوضاء فائقة. ثانيا ، يؤدي شكل الموجة إلى اكتشاف أفضل لإعادة الاستقطاب. ثالثا ، يساهم شكل مرحلة إعادة الاستقطاب في إلقاء نظرة ثاقبة على طريقة عمل مركب الاختبار ، والتي يوفرها انحدار استرخاء الإشارة. وأخيرا ، توفر هذه الطريقة حساسية محسنة للكشف عن الآثار الضارة الحرجة للأدوية ، كما يتضح من مثال التسجيل المعروض في الشكل 6 لحدوث EADs في liAP ولكن ليس في FP.

حتى الآن ، هناك طريقتان للوصول إلى AP داخل الخلايا. يتم تحقيق أول واحد عن طريق التثقيب الكهربائي26,27. هنا ، يمكن لنبضات الجهد القصيرة والقوية المطبقة عبر أقطاب التسجيل فتح غشاء الخلية28. الاحتمال الثاني هو فتح الغشاء عبر نبضة ليزر ، باستخدام ظاهرة فيزيائية تسمى رنين البلازمون السطحي ، كما هو موضح هنا. واحدة من المزايا مقارنة بالتثقيب الكهربائي هي زيادة احتمال الفتحات المتتالية. نظرا لبقعة الليزر عالية التركيز (1-3 ميكرومتر) ، يقتصر هذا التأثير محليا على القطب محل الاهتمام. ومن المثير للاهتمام ، أن بدء liAP لم يغير انتشار إشارة المخلوي المزروع. يشير هذا إلى أنه على الرغم من تلف سلامة الخلية ، لا يبدو أن خلايا عضلة القلب تزيل الاستقطاب عبر الثقب الموجود في الغشاء.

هناك قيود على هذه الطريقة. كما هو الحال مع التثقيب الكهربائي ، فإن فتحة الغشاء ، في معظم الحالات ، لا تدوم طوال الدورة التجريبية بأكملها. يجب تحديد الحد الأدنى من إعدادات الطاقة والمدة لنبضة الليزر المطلوبة للفتح المستقر لنوع الخلية المحدد محل الاهتمام بشكل مستقل قبل التجارب. وجدنا (غير معروض) أن المعلمات تختلف اختلافا جذريا بين أنواع الخلايا المختلفة (في حالتنا ، العديد من الخلايا العضلية القلبية الأولية المشتقة من hiPS). هذا يتجنب الضغط غير الضروري على الخلايا أثناء تجربة الاختبار المركب وينتج عنه بيانات أكثر موثوقية وقابلة للتكرار. من الأهمية بمكان ضبط المحور z لتوفير تركيز واضح على الخلايا والأقطاب الكهربائية. تنتج صورة الكاميرا غير المركزة بقعة ليزر تقع على مستوى دون المستوى الأمثل ، مما قد يؤدي إلى عدم القدرة على فتح غشاء الخلية. حتى مع أفضل المعلمات المعدلة ، يكون تأثير liAP عابرا ، وتقل السعة بمرور الوقت. علاوة على ذلك ، يختلف الوصول إلى الفضاء داخل الخلايا للخلايا بين تحريض liAP ، سواء داخل فتحات متتالية في نفس القطب وبين الأقطاب الكهربائية. ينتج عن هذا تباين كبير في سعة liAP. السبب ليس مفهوما تماما بعد. تشمل التفسيرات المحتملة المشكلات الميكانيكية مثل انحراف تركيز الليزر أو التوطين تحت الخلوي المختلف لفتح الغشاء. هذا يجعل تحليل تأثيرات السعة لمركبات الاختبار معقدا في هذه المرحلة الزمنية. كما أن تسجيل النشاط الكهربائي بواسطة نظام MEA يتطلب ترشيحا عالي التمريرات للتعويض عن انحراف خط الأساس الذي لا مفر منه. على الرغم من أنه في النظام المستخدم هنا ، تم ضبط هذا الترشيح على 0.1 هرتز (أدنى إعداد مرشح متاح لهذا النظام) ، إلا أن تأثيرات الترشيح خلال مرحلة الهضبة كانت لا تزال مرئية ، مما أدى إلى اتجاه بطيء لانحراف الجهد نحو خط الأساس خلال مرحلة الهضبة من AP القلب. هذا يمثل مشكلة خاصة مع APs الأساسية الطويلة على نطاق واسع مثل iPSC المشتقة من iPSC cardiomyocytes2 المستخدمة هنا ، والتي تولد بالفعل AP >700 مللي ثانية في ظل ظروف التحكم. قد يؤدي استخدام الأنظمة ذات الترشيح المنخفض إلى الحفاظ بشكل أفضل على شكل AP والسماح بوصول أفضل إلى المسار الزمني لمرحلة إعادة الاستقطاب.

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

يود المؤلفون أن يشكروا Foresee Biosystems على إقراض نظام IntraCell أثناء الدراسات. كما يودون أن يشكروا هاي إن تشانغ على المساعدة التقنية. حصل هذا العمل على تمويل من برنامج البحث والابتكار Horizon 2020 التابع للاتحاد الأوروبي بموجب اتفاقية المنحة رقم 964518 (ToxFree) ، ومن برنامج مجلس الابتكار الأوروبي Horizon Europe التابع للاتحاد الأوروبي ، ومشروع SiMulTox (اتفاقية المنحة رقم 101057769) ، ومن وزارة الدولة في بادن فورتمبيرغ للشؤون الاقتصادية والعمل والسياحة.

Materials

1 well MEA chip Multi Channel Systems MCS GmbH 890301
6 well MEA chip Multi Channel Systems MCS GmbH 7600069
DMSO Merck KGaA 20-139
Sigma-Aldrich		 solvent for drugs
Dofetilide ALOMONE LABS
ISRAEL HEADQUARTERS		 D-100 Drug-Measurement
dPBS Fisher Scientific GmbH 12037539 Coating
E4031 ALOMONE LABS
ISRAEL HEADQUARTERS		 E-500 Drug-Measurement
Falcon Fisher Scientific GmbH 10788561
FB Alps version 0.5.005 Foresee Biosystems
Fibronectin Merck KGaA 11051407001 Coating
iCell cardiomyocytes FUJIFILM Cellular
Dynamics, Inc. (FCDI)		 C1016
IntraCell Foresee Biosystems
IntraCell Foresee Biosystems
Isopropanol Carl Roth GmbH + Co. KG CN09.1 For cleaning of MEA contact pads
Maintenance Medium FUJIFILM Cellular
Dynamics, Inc. (FCDI)		 #M1003 For cell-culture
MC_Data Tool Multi Channel Systems MCS GmbH Data export
MC_Rack Multi Channel Systems MCS GmbH MEA recording
MEA 2100 – 2×60 – system Multi Channel Systems MCS GmbH 890485 For MEA-recordings
Nifedipine Merck KGaA N7634
Sigma-Aldrich		 Drug-Measurement
Plating Medium FUJIFILM Cellular
Dynamics, Inc. (FCDI)		 M1001 For cell-culture
Tergazyme VWR International, LLC 1304-1 cleaning of MEAs
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Shah, M., Akar, F. G., Tomaselli, G. F. Molecular basis of arrhythmias. Circulation. 112 (16), 2517-2529 (2005).
  2. Bowlby, M. R., Peri, R., Zhang, H., Dunlop, J. hERG (KCNH2 or Kv11.1) K+ channels: screening for cardiac arrhythmia risk. Current Drug Metabolism. 9 (9), 965-970 (2008).
  3. Priest, B. T., Bell, I. M., Garcia, M. L. Role of hERG potassium channel assays in drug development. Channels (Austin). 2 (2), 87-93 (2008).
  4. Fenton, F., Cherry, E., Glass, L. Cardiac arrhythmia. Scholarpedia. 3 (7), 1665 (2008).
  5. Tisdale, J. E., et al. Drug-induced arrhythmias: A scientific statement from the American Heart Association. Circulation. 142 (15), 214-233 (2020).
  6. Kramer, J., et al. MICE models: superior to the HERG model in predicting Torsade de Pointes. Scientific Reports. 3, 2100 (2013).
  7. Rampe, D., Roy, M. -. L., Dennis, A., Brown, A. M. A mechanism for the proarrhythmic effects of cisapride (Propulsid): high affinity blockade of the human cardiac potassium channel HERG. FEBS Letters. 417 (1), 28-32 (1997).
  8. Girouard, S. D., Laurita, K. R., Rosenbaum, D. S. Unique properties of cardiac action potentials recorded with voltage-sensitive dyes. Journal of Cardiovascular Electrophysiology. 7 (11), 1024-1038 (1996).
  9. Herron, T. J., Lee, P., Jalife, J. Optical imaging of voltage and calcium in cardiac cells & tissues. Circulation Research. 110 (4), 609-623 (2012).
  10. Hou, J. H., Kralj, J. M., Douglass, A. D., Engert, F., Cohen, A. E. Simultaneous mapping of membrane voltage and calcium in zebrafish heart in vivo reveals chamber-specific developmental transitions in ionic currents. Frontiers in Physiology. 5, 344 (2014).
  11. Ronzhina, M., et al. Di-4-ANEPPS modulates electrical activity and progress of myocardial ischemia in rabbit isolated heart. Frontiers in Physiology. 12, 1-15 (2021).
  12. Beck, C., Gong, Y. A high-speed, bright, red fluorescent voltage sensor to detect neural activity. Scientific Reports. 9 (1), 15878 (2019).
  13. Blinova, K., et al. International multisite study of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug proarrhythmic potential assessment. Cell Reports. 24 (13), 3582-3592 (2018).
  14. Kovacs, G. T. A. Electronic sensors with living cellular components. Proceedings of the IEEE. 91 (6), 915-929 (2003).
  15. Tertoolen, L. G. J., Braam, S. R., van Meer, B. J., Passier, R., Mummery, C. L. Interpretation of field potentials measured on a multi electrode array in pharmacological toxicity screening on primary and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Biochemical and Biophysical Research Communication. 497 (4), 1135-1141 (2018).
  16. Deo, M., Akwaboah, A., Tsevi, B., Treat, J. A., Cordeiro, J. M. Role of the rapid delayed rectifier K+ current in human induced pluripotent stem cells derived cardiomyocytes. Archives of Stem Cell and Therapy. 1 (1), 14-18 (2020).
  17. Hondeghem, L. M., Hoffmann, P. Blinded test in isolated female rabbit heart reliably identifies action potential duration prolongation and proarrhythmic drugs: importance of triangulation, reverse use dependence, and instability. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 41 (1), 14-24 (2003).
  18. Dipalo, M., et al. Intracellular action potential recordings from cardiomyocytes by ultrafast pulsed laser irradiation of fuzzy graphene microelectrodes. Science Advances. 7 (15), (2021).
  19. . R: A language and environment for statistical computing: R Foundation for Statistical Computing Available from: https://www.r-project.org/ (2021)
  20. Wickham, H. . ggplot2: Elegant graphics for data analysis. , (2009).
  21. . tidyr: Tidy messy data: R package version 1.2.0 Available from: https://tidyr.tidyverse.org (2022)
  22. . dplyr: A grammar of data manipulation. R package version 1.0.6 Available from: https://tidyr.tidyverse.org (2021)
  23. Godfraind, T. Discovery and development of calcium channel blockers. Frontiers in Pharmacology. 8, 286 (2017).
  24. Vater, W., et al. Pharmacology of 4-(2′-nitrophenyl)-2,6-dimethyl-1,4-dihydropyridine-3,5-dicarboxylic acid dimethyl ester (Nifedipine, BAY a 1040). Arzneimittelforschung. 22 (1), 1-14 (1972).
  25. Kim, I., Boyle, K. M., Carroll, J. L. Postnatal development of E-4031-sensitive potassium current in rat carotid chemoreceptor cells. Journal of Applied Physiology. 98 (4), 1469-1477 (2005).
  26. Edwards, S. L., et al. A multiwell cardiac µGMEA platform for action potential recordings from human iPSC-derived cardiomyocyte constructs. Stem Cell Reports. 11 (2), 522-536 (2018).
  27. Fendyur, A., Spira, M. E. Toward on-chip, in-cell recordings from cultured cardiomyocytes by arrays of gold mushroom-shaped microelectrodes. Frontiers in Neuroengineering. 5, 21 (2012).
  28. Hayes, H. B., et al. Novel method for action potential measurements from intact cardiac monolayers with multiwell microelectrode array technology. Scientific Reports. 9 (1), 11893 (2019).

Tags

Laser-induced Action PotentialMicroelectrode ArraysCardiomyocytesIntracellular Action PotentialsField Potential RecordingsStem Cell TechnologyCardiac DiseaseArrhythmiasCell CultivationFibronectinPlating MediumMEA SetupLaser FocusNoise Reduction

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Schaefer, J., Danker, T., Gebhardt, K., Kraushaar, U. Laser-Induced Action Potential-Like Measurements of Cardiomyocytes on Microelectrode Arrays for Increased Predictivity of Safety Pharmacology. J. Vis. Exp. (187), e64355, doi:10.3791/64355 (2022).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image