Preparazione, caratteristiche, tossicità e valutazione dell'efficacia del vaccino tumorale nanoemulsione autoassemblato nasale in vitro e in vivo

Come una delle innovazioni più importanti per la salute pubblica, i vaccini svolgono un ruolo chiave nella lotta contro l’onere globale delle malattie umane¹. Ad esempio, attualmente sono in fase di sperimentazione oltre 120 vaccini candidati per le malattie COVID-19, alcuni dei quali sono stati approvati in molti paesi². Rapporti recenti affermano che i vaccini contro il cancro hanno effettivamente migliorato i progressi dei trattamenti clinici contro il cancro perché dirigono il sistema immunitario dei malati di cancro a riconoscere gli antigeni come estranei al corpo³. Inoltre, epitopi multipli di cellule T situati all’interno o all’esterno delle cellule tumorali possono essere utilizzati per progettare vaccini peptidici, che hanno mostrato vantaggi nel trattamento dei tumori metastatici a causa della mancanza della significativa tossicità associata alla radioterapia e alla chemioterapia ^4,5. Dalla metà degli anni 1990, studi preclinici e clinici per il trattamento del tumore sono stati condotti principalmente utilizzando vaccini peptidici antigene, ma pochi vaccini mostrano un adeguato effetto terapeutico sui malati di cancro⁶. Inoltre, i vaccini antitumorali con epitopi peptidici hanno scarsa immunogenicità e insufficiente efficienza di consegna, che può essere dovuta alla rapida degradazione dei peptidi extracellulari che diffondono rapidamente dal sito di somministrazione, il che porta a un insufficiente assorbimento dell’antigene da parte delle cellule immunitarie⁷. Pertanto, è necessario superare questi ostacoli con la tecnologia di consegna del vaccino.

OAV_257-264, l’epitopo MHC di classe I legante 257-264 espresso come proteina di fusione, è un epitopo modello 8^{frequentemente} usato. Inoltre, l’OAV_257-264 è cruciale per la risposta immunitaria adattativa contro i tumori, che dipende dalla risposta citotossica dei linfociti T (CTL). È mediato dalle cellule T CD8⁺ antigene-specifiche nel tumore, che sono indotte dal peptide OAV_257-264 . È caratterizzato da un insufficiente granzima B, che viene rilasciato dalle cellule T citotossiche, portando all’apoptosi delle cellule bersaglio⁸. Tuttavia, la somministrazione di peptidi OAV_257-264 liberi può indurre poca attività CTL perché l’assorbimento di questi antigeni avviene in cellule non specifiche piuttosto che in cellule presentanti l’antigene (APC). La carenza di un’appropriata stimolazione immunitaria provoca l’attività CTL⁵. Pertanto, l’induzione di un’efficace attività CTL richiede notevoli progressi.

A causa della barriera fornita dalle cellule epiteliali e della continua secrezione di muco, gli antigeni del vaccino vengono rapidamente rimossi dalla mucosa nasale ^9,10. Lo sviluppo di un vettore vaccinale efficiente che possa passare attraverso il tessuto mucoso è fondamentale perché le cellule presentanti l’antigene sono situate sotto l’epitelio mucoso⁹. L’iniezione intranasale di vaccini induce teoricamente l’immunità mucosale per combattere l’infezione della mucosa¹¹. Inoltre, la somministrazione nasale è un metodo di somministrazione efficace e sicuro per i vaccini grazie alla sua praticità, all’evitamento della somministrazione intestinale e al miglioramento della conformità del paziente⁷. Pertanto, la consegna nasale è un buon mezzo di somministrazione per il nuovo nanovaccino epitopo peptidico.

Diversi biomateriali sintetici sono stati ideati per combinare epitopi di interazioni cellula-tessuto e cellula-cellula. Alcune proteine bioattive, come Ile-Lys-Val-Ala-Val (IKVAV), sono state introdotte come parte della struttura dell’idrogel per conferire bioattivit๲. Questo peptide probabilmente contribuisce all’attaccamento, alla migrazione e alla crescita delle cellule¹³ e lega le integrine α 3β1 e α_6β1 per interagire con diversi tipi di cellule tumorali. IKVAV è un peptide di adesione cellulare derivato dalla proteina di membrana basale della laminina α_{catena 1} che è stata originariamente utilizzata per modellare il microambiente neurale e causare la differenziazione neuronale¹⁴. Pertanto, trovare un veicolo di consegna efficiente per questo nuovo vaccino è importante per il controllo della malattia.

Sistemi di emulsione recentemente riportati, come W805EC e MF59, sono stati anche composti per la somministrazione della cavità nasale del vaccino influenzale inattivato o dell’antigene di superficie dell’epatite B ricombinante e illustrati per innescare sia l’immunità mucosale che sistemica¹⁵. Le nanoemulsioni (NE) presentano i vantaggi di una facile somministrazione e di una comoda co-formazione con adiuvanti efficaci rispetto ai sistemi di erogazione della mucosa particolata¹⁶. È stato segnalato che i vaccini a nanoemulsione alterano il fenotipo allergico in modo prolungato diverso dalla desensibilizzazione tradizionale, che si traduce in effetti soppressivi a lungo termine¹⁷. Altri hanno riferito che le nanoemulsioni combinate con antigeni immunodominanti specifici per Mtb potrebbero indurre potenti risposte delle cellule della mucosa e conferire una protezione significativa¹⁸. Pertanto, è stato progettato un nuovo nanovaccino autoassemblato intranasale con il peptide sintetico IKVAV-OVA 257-264 (I-OVA, il peptide costituito da IKVAV legato all’OVA_257-264). È importante valutare sistematicamente questo nuovo nanovaccino.

Lo scopo di questo protocollo è valutare sistematicamente le caratteristiche fisico-chimiche, la tossicità e la stabilità del nanovaccino, rilevare se l’assorbimento dell’antigene e gli effetti protettivi e terapeutici sono migliorati utilizzando mezzi tecnici ed elaborare i principali contenuti sperimentali. In questo studio, abbiamo stabilito una serie di protocolli per studiare le caratteristiche fisico-chimiche e la stabilità, determinare l’entità della tossicità dell’I-OVA NE alle cellule BEAS-2B da CCK-8 e osservare la capacità di presentare l’antigene delle cellule BEAS-2B al vaccino utilizzando la microscopia confocale, valutare i profili di rilascio di questo nuovo nanovaccino in vivo e in vitro.e rilevare l’effetto protettivo e terapeutico di questo vaccino utilizzando un modello murino portatore di tumore E.G7-OVA.