Detta protokoll beskriver en optimerad metod för histologisk observation av gallor inducerade av Plasmodiophora brassicae. Vibratomsektioner av hypokotyler rensas före fluorescensavbildning för att studera involvering av transkriptionsfaktorer och fytohormoner under sjukdomsprogression. Detta protokoll övervinner hartsinbäddningsbegränsningar, vilket möjliggör visualisering av fluorescerande proteiner i planta .
Infektion av Brassica-grödor av den jordburna protisten Plasmodiophora brassicae leder till gallbildning på de underjordiska organen. Bildandet av galls kräver cellulär omprogrammering och förändringar i metabolismen hos den infekterade växten. Detta är nödvändigt för att upprätta en patogenorienterad fysiologisk sänka mot vilken värdnäringsämnena omdirigeras. För en fullständig förståelse av denna speciella växt-patogeninteraktion och de mekanismer genom vilka värdtillväxt och utveckling undergrävs och remönstered, är det viktigt att spåra och observera de interna förändringarna som åtföljer gallbildning med cellulär upplösning. Metoder som kombinerar fluorescerande fläckar och fluorescerande proteiner används ofta för att studera anatomiska och fysiologiska svar i växter. Tyvärr fungerar den stora storleken på gallor och deras låga transparens som stora hinder för att utföra helmonterade observationer under mikroskopet. Dessutom begränsar låg transparens användningen av fluorescensmikroskopi för att studera klubbrotsjukdomsprogression och gallbildning. Denna artikel presenterar en optimerad metod för fixering och rensning av gallor för att underlätta epifluorescens och konfokalmikroskopi för inspektion av P. brassicae-infekterade gallor. Ett vävnadsrensningsprotokoll för snabb optisk clearing användes följt av vibratomsektionering för att detektera anatomiska förändringar och lokalisera genuttryck med promotorfusioner och reporterlinjer märkta med fluorescerande proteiner. Denna metod kommer att visa sig vara användbar för att studera cellulära och fysiologiska svar i andra patogenutlösta strukturer i växter, såsom nematodinducerad syncytia och rotknutar, samt bladgaller och deformationer orsakade av insekter.
Växter som påverkas av patogener eller insekter kan utveckla onormala strukturer (organdeformationer eller galls), vilket gör det möjligt för inkräktaren att inta näringsämnen och reproducera1. Här genomfördes ett effektivt histopatologiskt tillvägagångssätt för att studera de förändringar som sker i galls som utvecklas på de underjordiska delarna av växter infekterade med protisten Plasmodiophora brassicae (Figur 1). Den mindre tråden i samband med denna patogen framgår av det faktum att P. brassicae vilande sporer kan behålla sin förmåga att invadera växter i många år. Vid storskalig odling av raps (Brassica napus) är detta ett allvarligt problem eftersom ekonomiska faktorer begränsar växtföljden, vilket leder till vilande sporansamling i jorden2. Rapsens resistens mot klubbrotssjukdom orsakad av P. brassicae är genetiskt bestämd. Tyvärr överlistar patogenen ofta resistens på grund av dess biologi och den smala genetiska poolen från vilken raps härstammar. Därför har det blivit relevant att studera svaren efter infektion hos värdväxter och deras förmåga att bromsa sjukdomsprogressionen eller förhindra att vissa symtom utvecklas.
Vid clubroot-sjukdom utvärderas svårighetsgraden i allmänhet baserat på utvecklingen av galls och graden av rotsystemskada. Detta är känt som Disease Index-DI3. Det fångar emellertid inte helt den sanna bedömningen av denna växt-patogeninteraktion. I synnerhet tar det inte upp hur patogenen fördelas i rötterna och om växten kan begränsa P. brassicae rörelse i dess vävnader. Vidare är det inte lätt att förutse i vilken utsträckning P. brassicae omprogrammerar underjordisk organanatomi. Studier på modellanläggningen Arabidopsis thaliana har visat att P. brassicae infektion leder till hämning av xylogenes (både initierings- och mognadsstegen) och förbättring av floemdifferentiering inom galls4,5. Dessutom, i rötter och hypokotyler av infekterade växter, slutar kambialcellavkomman inte det mitotiska tillståndet och sprider sig längre än i friska växter6. Denna process styr gallens slutliga storlek och bestämmer antalet patogen vilande sporer som produceras inom den infekterade växten. P. brassicae-driven utvecklings-, metabolisk och fysiologisk omprogrammering i värden är mycket komplex7; Därför är tillämpningen av verktyg som möjliggör inspektion av interna förändringar inom galls avgörande för att korrekt bedöma denna interaktion. Livscykelprogressionen för P. brassicae åtföljs av omprogrammering av värdcellmetabolismen, som kan observeras som stärkelse eller lipidavsättning7,8. Det största hindret för en framgångsrik mikroskopi av galls kommer från deras låga transparens. På grund av detta härstammar majoriteten av histologiska exemplar som presenterar klubbrotdrivna förändringar inom galls från fixerings-inbäddningstekniker (vax eller harts) följt av mikrotomsektionering. Sådana tillvägagångssätt användes framgångsrikt för att lokalisera promotoraktiviteten för många gener som är aktiva i klubbrotgaller4,5 eller olika färgningstekniker som underlättar observationen av P. brassicae livscykelprogression9. Det måste dock noteras att fixerings- och inbäddningsstegen är tidskrävande och resulterar i partiell eller fullständig tvättning av viktiga biomolekyler (t.ex. lipider), vilket avsevärt hindrar vissa observationer. Nyligen P. brassicae livscykelprogression i värden visualiserades med hjälp av Fluorescerande In Situ Hybridization (FISH), där ett metyltransferas av SABATH-typ (PbBSMT) genspecifik sond användes för att markera vilande sporbildning10. Ett bra alternativ är användningen av andra fluorescensbaserade metoder där autofluorescensen hos vissa cellulära komponenter, aktiviteten hos 5′- uppströms reglerande regioner av gener smälta till fluorescerande proteinmarkörer och ackumuleringen av vissa fluorescerande märkta proteiner kan ses. Förutom provernas låga transparens arbetar emellertid en stor nackdel med sådana objekt med ofixerade prover, vilket avsevärt minskar den tid då bilder av god kvalitet kan dokumenteras. År 2015, Kurihara et al.11 utvecklat ett clearingreagens som möjliggör bevarande av fluorescerande proteiner och ökar transparensen hos växtvävnadsprover. Dessutom är den kompatibel med många histologiska fläckar. Nyligen tillämpades samma teknik framgångsrikt för att visualisera olika cellväggskomponenter i växtvävnader12,13. Här har detta protokoll använts för att analysera olika klubbrotsgallutvecklingsaspekter. Arbetsflödet börjar med fixering av galls, vibratomsektionering, vävnadsrensning, färgning och fluorescensavbildning. Beroende på ens behov, direkt eller efter särskild färgning, kan de resulterande sektionerna utsättas för inspektion under ett epifluorescens eller konfokalmikroskop. Denna metod ger en effektiv lösning för att studera lokala förändringar i genuttryck och fysiologiska svar, inklusive fytohormonbalans och signalering. Sjukdomsprogression kan spåras genom att titta på fördelningsmönstret för vilosporer och mognadsdynamik. Dessutom kan protokollet enkelt tillämpas för avbildning av karakteristiska förändringar inom P. brassicae infekterade växter, inklusive hämning av xylogenes eller värdväxtens försvarssvar synliga som lokal lignifiering i resistenta genotyper. Exempel i detta protokoll kommer från avbildning som utförs på Arabidopsis thaliana modell; protokollet kan dock även tillämpas på andra arter av grödor som tillhör Brassicaceae familj. Metoden som beskrivs nedan kommer att underlätta framtida detaljerade studier av cellulära strukturer och molekylära förändringar som åtföljer gallbildning i P. brassicae-infekterade växter.
Protokollets allmänna arbetsflöde är ganska enkelt, och alla stadier av gallutveckling kan enkelt avbildas och karakteriseras (figur 2). Eftersom P. brassicae är en jordburen patogen måste alla experiment utföras i jordbaserade system. Patogenen föredrar sura förhållanden; Därför måste icke-kalkbehandlade jordsubstrat användas. Även om P. brassicae inte utgör ett hot mot människor, är det strikt en växtpatogen som kan spridas genom mark och vatten. Därför måste alla delar av den infekterade växten, liksom jorden, förstöras efter experimentet genom autoklavering eller genom behandling med blekmedel.
Att applicera röjningslösningen på vibratomskurna gallpartier förbättrar säkert förmågan att studera den biotrofiska interaktionen mellan P. brassicae och värdväxten. Även om clearingprotokollet gäller även för handsektioner, fungerar det bättre med vibratomsektioner. Fixering av prover i PFA-fixeringsmedel fungerar som ett kritiskt steg i protokollet eftersom prover sedan kan förvaras vid 4 °C i några dagar innan de fortsätter med sektionering. Detta ger flexibilitet att lagra prover under en begränsad period utan att kompromissa med uttrycket och bevarandet av fluorescerande proteiner under fixering.
Nilen röd (i DMSO eller metanol) är oförenlig med hartssektioner på grund av dess hydrofobicitet, som löser upp harts och förstör hartsinbäddade sektioner17. Således visar vibratomsektioner sig vara avgörande för att studera patogenfördelningen och dess livscykel inom utvecklande galls, vari Nile Red-färgning lätt kan användas.
Clearinglösningen som används i detta protokoll är mycket mångsidig12, vilket gör att en mängd olika fluorescensfläckar kan användas i olika kombinationer för att färga olika biomolekyler / komponenter i cellväggarna (suberin, lignin, cellulosa och kitin i svampinteraktioner). Det är också möjligt att motverka sektioner av fluorescerande GFP-markörlinjer och därigenom korrelera promotoraktiviteten eller proteinackumuleringsmönstret med närvaron av patogenen i vissa celler eller regioner i gallan. Bakgrundsautofluorescens från xylem och patogenfyllda jätteceller kunde emellertid inte elimineras även efter clearingprotokollet. Detta utgör en begränsning för att titta på fluorescerande markörer under de senare stadierna av gallbildning, särskilt när man använder ett epifluorescensmikroskop och avbildar svaga signaler.
På grund av de låga nivåerna av uttryck / ackumulering av fluorescerande signaler är transkriptionsfaktorer svåra att upptäcka, men med denna teknik är det möjligt att få tillfredsställande bilder för dem. Sammantaget utökar kombinationen av vibratomsektionering med vävnadsrensningsmetoden verktygslådan för histologiska observationer av komplexa gallvävnader. Flexibiliteten i detta protokoll underlättar processen för vävnadsfixering och minskar den tid som krävs för att skära och avbilda färska vävnadsprover för att observera fluorescerande proteiner och promotoraktiviteter. Med ytterligare förbättringar och genom att använda andra fluorescerande färgämnen som är specifika för olika biomolekyler kommer denna metod att markera större framsteg inom histologiska studier och bildanalys av täta, ogenomskinliga vävnader med komplex vävnadsorganisation. På senare tid har den presenterade vävnadsrensningsmetoden framstått som ett populärt och allmänt använt protokoll för att kombinera och möjliggöra samtidig förvärv av olika fluorescerande signaler11,12,13. Framtida utveckling och modifieringar av sådana tekniker kommer att förbättra bildupplösningen avsevärt för att observera växtpatogeninteraktioner på cellulär nivå.
The authors have nothing to disclose.
Arbetet stöddes av National Science Centre Poland OPUS17 bidrag nr 2019/33/B/NZ9/00751 “Long distance Vascular Coordination in Plants Infected by Plasmodiophora brassicae“. Vi tackar prof. Yrjö Helariutta (Sainsbury Laboratory, University of Cambridge) för att ha delat proHCA2::erRFP-linjen .
2N Sulfuric acid (H2SO4) | Roth | UN2796 | pH adjustment |
Agarose | PRONA | BGQT100 | Embedding |
Basic Fuchsin | BIOSHOP | BSF410.5 | Fluorescent dye |
Calcofluor White | Sigma Aldrich | 18909-100ML-F | Fluorescent dye |
Commercial Bleach | Domestos | ||
Cyanoacrylate/ Instant glue | Kropelka | Adhesive | |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | BIOSHOP | DMS555.500 | Solvent |
Epifluorescence microscope | Carl Zeiss M2 automated epifluorescence microscope with Colibri LED system | Carl Zeiss M2 | Carl Zeiss Filter Set filter set 38, 43, 49 used |
Fully automated Vibratome | Leica | VT1200 S | |
Lightmeter /Photometer | LI-COR Biosciences | LI-250A + LI-190R quantum sensor | For measuring light intensity within the 400-700nm (PAR) waveband |
Masking tape | For sticking agarose block on mould | ||
Murashige & Skoog Medium (MS Medium) | Duchefa Biochemie | MO222.0050 | Plant Growth Medium |
Nile Red | Sigma Aldrich | N3013-100MG | Fluorescent dye |
Paraformaldehyde PFA | Sigma Aldrich | 158127-100G | Fixative |
Potassium Chloride (KCl) | POCH | 739740114 | PBS component |
Potassium Hydroxide (KOH) | Sigma Aldrich | P1767-250G | pH adjustment |
Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | BIOSHOP | PPM302.500 | PBS component |
Sodium chloride (NaCl) | BIOSHOP | SOD001.1 | PBS component |
Sodium Deoxycholate | Sigma Aldrich | D6750-25G | Clearing Solution |
Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4 · 2H2O) | POCH | 799490116 | PBS component |
Triton X-100 | BIOSHOP | TRX506.100 | Fixative |
Urea | Sigma Aldrich | U5378-100G | Clearing Solution |
Vacuum/Pressure pump and Dessicator | Welch by Gardner Denver | 2522C-02 | For Vacuum Infilteration |
Xylitol | Sigma Aldrich | X3375-25G | Clearing Solution (componenet) |