הדמיה חיה של אבות לב מוקדמים בעובר העכבר
Summary
אנו מציגים פרוטוקול מפורט לתרבית והדמיית עוברי עכבר המאפשר הדמיה תלת ממדית + זמן של תאי אב לבביים. ערכת כלי וידאו זו מתייחסת למיומנויות המפתח הנדרשות להדמיה חיה מוצלחת שאחרת קשה לרכוש מפרסומים של טקסט בלבד.
Abstract
השלבים הראשונים של התפתחות הלב מרמזים על שינויים דרסטיים בהתנהגות התאים ובהתמיינותם. בעוד ניתוח של עוברים קבועים מאפשר ללמוד בפירוט שלבים התפתחותיים ספציפיים בתמונת סטילס, הדמיה חיה לוכדת אירועים מורפוגנטיים דינמיים, כגון נדידת תאים, שינויי צורה והתמיינות, על ידי הדמיה של העובר תוך כדי התפתחותו. זה משלים ניתוח קבוע ומרחיב את ההבנה של איך איברים מתפתחים במהלך embryogenesis. למרות יתרונותיה, הדמיה חיה משמשת לעתים רחוקות במודלים של עכברים בגלל האתגרים הטכניים שלה. עוברי עכבר מוקדמים רגישים כאשר הם מתורבתים ex vivo ודורשים טיפול יעיל. כדי להקל על שימוש נרחב יותר בדימות חי במחקר התפתחותי של עכברים, מאמר זה מציג פרוטוקול מפורט למיקרוסקופ חי של שני פוטונים המאפשר רכישה ארוכת טווח בעוברי עכברים. בנוסף לפרוטוקול, ניתנים טיפים על טיפול בעוברים ואופטימיזציה של תרבית. זה יעזור להבין אירועי מפתח באורגנוגנזה מוקדמת של עכברים, וישפר את ההבנה של ביולוגיה של אבות לב וכלי דם.
Introduction
הלב נוצר מוקדם במהלך האמבריוגנזה כדי להתחיל לשאוב חומרים מזינים לעובר כולו, בעוד הוא ממשיך להתפתח1. בעוברי עכברים, יום וחצי לאחר תחילת הגסטרולציה, איבר לב בסיסי מתכנס בקוטב הקדמי 2,3. בשלב הפס המוקדם (ES), אבות הלב באפיבלסט חודרים דרך הפס הפרימיטיבי לשכבה המזודרמלית המתהווה 4,5,6 ומתחילים לנדוד לקוטב הקדמי, שם הם מתמיינים ליצירת צינור הלב הפרימיטיבי. במהלך התהליך הזה, אבות לב מוקדמים עוברים סידור מחדש של תאים, שינוי צורה והתמיינות, בנוסף לנדידה7 (איור 1).
אבות לב מוקדמים משכו חוקרים במשך כמעט מאה שנה בשל יכולתם יוצאת הדופן להבדיל ולבנות איבר פונקציונלי בו זמנית. במהלך שני העשורים האחרונים, ניתוח שבטים ומודלים של נוקאאוט מותנה הראו כי התפתחות לב מוקדמת מסבכת מקורות תאים שונים בתהליך דינמי מאוד 8,9,10. אולם המבנה התלת-ממדי של צינור הלב הפרימיטיבי והאופי הדינמי של המורפוגנזה שלו הופכים אותו למאתגר למחקר (איור 1), ואנו רחוקים מלהבין את מלוא מורכבותו11.
כדי לחקור את התהליכים התאיים הדינמיים האלה, שיטות הדמיה חיה מציעות כעת פירוט חסר תקדים 7,12,13,14. במודל העכבר, גישות חיות היו המפתח לחקר נושאים התפתחותיים שקשה לטפל בהם באמצעות ניתוח סטטי 7,13,15. בעוד תרבית אקס ויו ארוכת טווח ומערכי מיקרוסקופ חזקים מתקדמים במהירות16,17, רק לחוקרים מעטים יש את המומחיות לצלם בהצלחה עוברים חיים. למרות שפרסומים מבוססי נייר מספקים מספיק פרטים טכניים כדי לשחזר ניסויי הדמיה חיים, קשה לתפוס כמה מיומנויות וטריקים ללא דוגמאות חזותיות או סיוע עמית לעמית. כדי להאיץ את תהליך הלמידה הזה ולהפיץ את השימוש בהדמיה חיה בין מעבדות, הרכבנו פרוטוקול וידאו (איור 2) שאוסף את הכישורים הדרושים לביצוע הדמיה חיה על עוברי עכברים מגרדים.
איור 1: התמיינות מוקדמת של תאי אב לבביים בעובר עכבר מתחילת הגסטרולציה ועד לשלב שקדם להיווצרות צינור הלב הפרימיטיבי. תאי אב לבביים חודרים למזודרם זמן קצר לאחר תחילת הגסטרולציה, נודדים לצד הנגדי של העובר. שלב היום המורפולוגי והיום העוברי (E) כתובים על גבי התרשימים. חצים מקווקווים מתארים את מסלול הנדידה של אבות צינור הלב הפרימיטיביים במהלך הגסטרולציה. נתון זה הותאםמ-11. קיצורים: ES = פס מוקדם; MS = פס אמצעי; EHF = קיפול ראש מוקדם. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: דיאגרמת זרימת עבודה עבור הדמיה חיה של אבות לב מוקדמים. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Protocol
Representative Results
Discussion
אבות הלב המוקדמים מתארגנים בצינור לב פרימיטיבי שמתחיל לפעום בזמן שהוא עדיין נוצר. הבנת האופן שבו תהליך זה מתרחש היא המפתח לאיתור הספקטרום הרחב של מומי לב מולדים לאירועים מורפוגנטיים ספציפיים. לשם כך, הדמיה חיה מציעה הזדמנות לחקור התפתחות עוברית תקינה ופגומית ברזולוציה טמפורלית מוגברת. ז?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים לד”ר קנזו איבנוביץ’ על עבודתו הקודמת על שיטה זו ולקבוצתו של ד”ר שיגנורי נונקה (המכונים הלאומיים למדעי הטבע, יפן) על מתן המומחיות הראשונית בהרכבת עוברים. מחקר זה נתמך על ידי Grant PGC2018-096486-B-I00 מ-Ministerio de Ciencia e Innovación הספרדי ומענק H2020-MSCA-ITN-2016-722427 מתוכנית Horizon 2020 של האיחוד האירופי ל-MT ומענק 1380918 מתוכנית ההפעלה FEDER Andalucía 2014-2020 ל-JND. MS נתמכה על ידי מלגת La Caixa Foundation PhD (LCF / BQ / DE18/11670014) ומלגת הנסיעות של חברת הביולוגים (DEVTF181145). CNIC נתמך על ידי משרד המדע הספרדי וקרן ProCNIC.
Materials
| #55 Forceps | Dumont | 11295-51 | |
| 35 mm Dish with glass coverslip bottom 14 mm Diameter | Mattek | P35G-1.5-14-C | |
| 35 mm vise table | Grandado | SKU 8798771617573 | |
| 50 mL tubes | BD Falcon | 352070 | |
| Distilled water | |||
| DMEM – Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 11966025 | with L-Glutamine, without Glucose, without Na Pyruvate |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 10438-026 | |
| Fluorescent reporter transgenic mice (Tg(CBF:H2BVenus,+) | JAX | ||
| Fluorobrite DMEM | ThermoFisher | A1896701 | DMEM for live-cell imaging |
| High-vacuum silicone grease | Dow Corning | Z273554-1EA | |
| Holder for wires | Perlen Pressen | pwb1 | |
| LSM 780 Upright microscope | Zeiss | ||
| MaiTai Deepsee far red pulsed-laser tuned at 980 nm | Spectra-Physics | ||
| Non Descanned Detectors equipped with the filter sets cyan-yellow (BP450-500/BP520-560), green-red (BP500-520/BP570-610) and yellow-red (BP520-560/BP645-710) |
Zeiss | ||
| Obj: 20x water dipping 1.0 NA, long working distance | Zeiss | ||
| P1000 and P200 pipettes | |||
| Paraffin Oil | Nidacon | VNI0049 | |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | (the final concentration should be 50 μg/mL penicillin and 50 μg/mL streptomycin) |
| Petri dishes 35 mm x 10 mm | BD Falcon | 351008 | |
| Pipette tips | |||
| Polymethyl methacrylate | Reused from old laboratory equipment | ||
| Rat Serum culture embryo, male rats SPRAGUE DAWLEY RjHan SD | Janvier Labs | 9979 | |
| Set of 160 mm fines | RS PRO | 541-6933 | |
| Standard 1.0 mm glass capillaries | Anima Lab | 1B100F-3 | |
| Sterile 0.22 μm syringe filter | Corning | 431218 | |
| Sterile 5 mL syringe | Fisher Scientific | 15809152 | |
| Tungsten needles | |||
| Ultrasonic homogeniser (sonicator) | Bandelin | BASO_17021 |
Riferimenti
- Tyser, R. C. V., et al. Calcium handling precedes cardiac differentiation to initiate the first heartbeat. eLife. 5, 17113 (2016).
- Kelly, R. G., Buckingham, M. E., Moorman, A. F. Heart fields and cardiac morphogenesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4 (10), 015750 (2014).
- Evans, S. M., Yelon, D., Conlon, F. L., Kirby, M. L. Myocardial lineage development. Circulation Research. 107 (12), 1428-1444 (2010).
- Tam, P. P., Parameswaran, M., Kinder, S. J., Weinberger, R. P. The allocation of epiblast cells to the embryonic heart and other mesodermal lineages: the role of ingression and tissue movement during gastrulation. Development. 124 (9), 1631-1642 (1997).
- Kinder, S. J., Loebel, D. A. F., Tam, P. P. L. Allocation and early differentiation of cardiovascular progenitors in the mouse embryo. Trends in Cardiovascular Medicine. 11 (5), 177-184 (2001).
- Lawson, K. A. Fate mapping the mouse embryo. International Journal of Developmental Biology. 43 (7), 773-775 (1999).
- Ivanovitch, K., Temiño, S., Torres, M. Live imaging of heart tube development in mouse reveals alternating phases of cardiac differentiation and morphogenesis. eLife. 6, 30668 (2017).
- Meilhac, S. M., Buckingham, M. E. The deployment of cell lineages that form the mammalian heart. Nature Reviews Cardiology. 15 (11), 705-724 (2018).
- Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells. Nature Reviews Genetics. 6 (11), 826-835 (2005).
- Meilhac, S. M., Lescroart, F., Blanpain, C. D., Buckingham, M. E. Cardiac cell lineages that form the heart. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4 (9), 013888 (2014).
- Sendra, M., Domínguez, J. N., Torres, M., Ocaña, O. H. Dissecting the complexity of early heart progenitor cells. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 9 (1), 5 (2022).
- McDole, K., et al. In toto imaging and reconstruction of post-implantation mouse development at the single-cell level. Cell. 175 (3), 859-876 (2018).
- Saykali, B., et al. Distinct mesoderm migration phenotypes in extra-embryonic and embryonic regions of the early mouse embryo. eLife. 8, 42434 (2019).
- Ichikawa, T., et al. Live imaging of whole mouse embryos during gastrulation: Migration analyses of epiblast and mesodermal cells. PLoS ONE. 8 (7), 64506 (2013).
- Tyser, R. C. V., et al. Single-cell transcriptomic characterization of a gastrulating human embryo. Nature. 600 (7888), 285-289 (2021).
- Aguilera-Castrejon, A., et al. Ex utero mouse embryogenesis from pre-gastrulation to late organogenesis. Nature. 593 (7857), 119-124 (2021).
- Yue, Y., et al. in toto live imaging of cardiomyocyte behaviour during mouse ventricle chamber formation at single-cell resolution. Nature Cell Biology. 22 (3), 332-340 (2020).
- Nowotschin, S., Xenopoulos, P., Schrode, N., Hadjantonakis, A. K. A bright single-cell resolution live imaging reporter of Notch signaling in the mouse. BMC Developmental Biology. 13 (1), 15 (2013).
- Cold Spring Harbor Protocols. Sharpened tungsten needles. Cold Spring Harbor Protocols. , (2012).
- Tam, P. P., Snow, M. H. The in vitro culture of primitive-streak-stage mouse embryos. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 59, 131-143 (1980).
- Garcia, M. D., Udan, R. S., Hadjantonakis, A. K., Dickinson, M. E. Preparation of rat serum for culturing mouse embryos. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (4), 5593 (2011).
- Tam, P. P. L. Postimplantation mouse development: Whole embryo culture and micro- manipulation. International Journal of Developmental Biology. 42 (7), 895-902 (1998).
- Optimización de propiedades fisicoquímicas y medios de cultivo para el cultivo del embrión de ratón ex vivo. Universidad de Jaén. Biología Experimental Available from: https://hdl.handle.net/10953.1/1400 (2021)
- Behringer, R., Gertsenstein, M., Vintersen Nagy, K., Nagy, A. . Manipulating the mouse embryo: A laboratory manual, Fourth Edition. , 814 (2014).
- Shea, K., Geijsen, N. Dissection of 6.5 dpc mouse embryos. Journal of Visualized Experiments. (2), e160 (2006).
- Nonaka, S. Modification of mouse nodal flow by applying artificial flow. Methods in Cell Biology. 91, 287-297 (2009).
- Garcia, M. D., Udan, R. S., Hadjantonakis, A. K., Dickinson, M. E. Time-lapse imaging of postimplantation mouse embryos. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (4), 5595 (2011).
- Crainiciuc, G., et al. Behavioural immune landscapes of inflammation. Nature. 601 (7893), 415-421 (2022).
