Imaging dal vivo dei primi progenitori cardiaci nell'embrione di topo
Summary
Presentiamo un protocollo dettagliato per la coltura e l’imaging di embrioni di topo che consente l’imaging 3D + tempo delle cellule progenitrici cardiache. Questo video-toolkit affronta le competenze chiave necessarie per immagini live di successo altrimenti difficili da acquisire da pubblicazioni di solo testo.
Abstract
I primi passi dello sviluppo del cuore implicano drastici cambiamenti nel comportamento e nella differenziazione cellulare. Mentre l’analisi degli embrioni fissi consente di studiare in dettaglio specifiche fasi di sviluppo in un’istantanea fissa, l’imaging dal vivo cattura eventi morfogenetici dinamici, come la migrazione cellulare, i cambiamenti di forma e la differenziazione, visualizzando l’embrione mentre si sviluppa. Questo integra l’analisi fissa e amplia la comprensione di come gli organi si sviluppano durante l’embriogenesi. Nonostante i suoi vantaggi, l’imaging dal vivo è raramente utilizzato nei modelli murini a causa delle sue sfide tecniche. I primi embrioni di topo sono sensibili se coltivati ex vivo e richiedono una manipolazione efficiente. Per facilitare un uso più ampio dell’imaging dal vivo nella ricerca sullo sviluppo del topo, questo articolo presenta un protocollo dettagliato per la microscopia viva a due fotoni che consente l’acquisizione a lungo termine negli embrioni di topo. Oltre al protocollo, vengono forniti suggerimenti sulla gestione degli embrioni e sull’ottimizzazione della coltura. Ciò aiuterà a comprendere gli eventi chiave nell’organogenesi precoce del topo, migliorando la comprensione della biologia dei progenitori cardiovascolari.
Introduction
Il cuore si forma presto durante l’embriogenesi per iniziare a pompare sostanze nutritive all’intero embrione, mentre continua a svilupparsi1. Negli embrioni di topo, un giorno e mezzo dopo l’inizio della gastrulazione, un organo cardiaco rudimentale si assembla al polo anteriore 2,3. Allo stadio Early Streak (ES), i progenitori cardiaci nell’ingresso dell’epiblasto attraverso la striscia primitiva fino allo strato mesodermico nascente 4,5,6 e iniziano a migrare verso il polo anteriore, dove si differenziano per formare il tubo cardiaco primitivo. Durante questo processo, i primi progenitori cardiaci subiscono riarrangiamenti cellulari, trasformazioni di forma e differenziazione, oltre alla migrazione7 (Figura 1).
I primi progenitori cardiaci hanno attratto ricercatori per quasi un secolo grazie alla loro notevole capacità di differenziare e costruire un organo funzionale contemporaneamente. Negli ultimi due decenni, l’analisi clonale e i modelli di knockout condizionale hanno dimostrato che lo sviluppo precoce del cuore implica fonti cellulari distinte in un processo altamente dinamico 8,9,10. Tuttavia, la struttura 3D del tubo cardiaco primitivo e la natura dinamica della sua morfogenesi lo rendono difficile da studiare (Figura 1), e siamo lontani dal comprendere la sua piena complessità11.
Per studiare questi processi cellulari dinamici, i metodi di imaging dal vivo offrono ora un dettaglio senza precedenti 7,12,13,14. Nel modello murino, gli approcci dal vivo sono stati fondamentali per interrogare argomenti di sviluppo che sono difficili da affrontare con l’analisi statica 7,13,15. Mentre la coltura ex vivo a lungo termine e le configurazioni di microscopi robusti stanno avanzando rapidamente16,17, pochi ricercatori hanno l’esperienza per visualizzare con successo embrioni vivi. Sebbene le pubblicazioni cartacee forniscano dettagli tecnici sufficienti per riprodurre esperimenti di imaging dal vivo, alcune abilità e trucchi sono difficili da comprendere senza esempi visivi o assistenza peer-to-peer. Per accelerare questo processo di apprendimento e diffondere l’uso dell’imaging dal vivo tra i laboratori, abbiamo assemblato un protocollo video (Figura 2) che raccoglie le competenze necessarie per eseguire l’imaging dal vivo su embrioni di topo gastrulati.
Figura 1: Differenziazione precoce delle cellule progenitrici cardiache nell’embrione di topo dall’inizio della gastrulazione allo stadio che precede la formazione primitiva del tubo cardiaco. Le cellule progenitrici cardiache entrano nel mesoderma subito dopo l’inizio della gastrulazione, migrando verso il lato opposto dell’embrione. La fase morfologica ed embrionale del giorno (E) sono scritte in cima ai diagrammi. Le frecce tratteggiate raffigurano la traiettoria di migrazione dei progenitori primitivi del tubo cardiaco durante la gastrulazione. Questa cifra è stata adattata da11. Abbreviazioni: ES = Early Streak; MS = Striscia media; EHF = Early Head Fold. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Diagramma del flusso di lavoro per l’imaging in tempo reale dei primi progenitori cardiaci. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Protocol
Representative Results
Discussion
I primi progenitori del cuore si organizzano in un tubo cardiaco primitivo che inizia a battere mentre si sta ancora formando. Capire come avviene questo processo è la chiave per individuare l’ampio spettro di difetti cardiaci congeniti a specifici eventi morfogenetici. Per questo, l’imaging dal vivo offre l’opportunità di studiare lo sviluppo embrionale normale e difettoso con una maggiore risoluzione temporale. Ciò è particolarmente utile per studiare le cellule progenitrici cardiache precoci mentre passano rapidam…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori riconoscono il Dr. Kenzo Ivanovitch per il precedente lavoro su questo metodo e il gruppo del Dr. Shigenori Nonaka (National Institutes of Natural Sciences, Giappone) per aver fornito le competenze iniziali sul montaggio degli embrioni. Questo studio è stato supportato da Grant PGC2018-096486-B-I00 del Ministerio de Ciencia e Innovación spagnolo e Grant H2020-MSCA-ITN-2016-722427 dal programma Horizon 2020 dell’UE a MT e Grant 1380918 dal programma operativo FEDER Andalucía 2014-2020 a JND. MS è stata sostenuta da una borsa di dottorato della Fondazione La Caixa (LCF / BQ / DE18 / 11670014) e dalla borsa di studio itinerante The Company of Biologists (DEVTF181145). Il CNIC è sostenuto dal Ministero della Scienza spagnolo e dalla Fondazione ProCNIC.
Materials
| #55 Forceps | Dumont | 11295-51 | |
| 35 mm Dish with glass coverslip bottom 14 mm Diameter | Mattek | P35G-1.5-14-C | |
| 35 mm vise table | Grandado | SKU 8798771617573 | |
| 50 mL tubes | BD Falcon | 352070 | |
| Distilled water | |||
| DMEM – Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 11966025 | with L-Glutamine, without Glucose, without Na Pyruvate |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 10438-026 | |
| Fluorescent reporter transgenic mice (Tg(CBF:H2BVenus,+) | JAX | ||
| Fluorobrite DMEM | ThermoFisher | A1896701 | DMEM for live-cell imaging |
| High-vacuum silicone grease | Dow Corning | Z273554-1EA | |
| Holder for wires | Perlen Pressen | pwb1 | |
| LSM 780 Upright microscope | Zeiss | ||
| MaiTai Deepsee far red pulsed-laser tuned at 980 nm | Spectra-Physics | ||
| Non Descanned Detectors equipped with the filter sets cyan-yellow (BP450-500/BP520-560), green-red (BP500-520/BP570-610) and yellow-red (BP520-560/BP645-710) |
Zeiss | ||
| Obj: 20x water dipping 1.0 NA, long working distance | Zeiss | ||
| P1000 and P200 pipettes | |||
| Paraffin Oil | Nidacon | VNI0049 | |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | (the final concentration should be 50 μg/mL penicillin and 50 μg/mL streptomycin) |
| Petri dishes 35 mm x 10 mm | BD Falcon | 351008 | |
| Pipette tips | |||
| Polymethyl methacrylate | Reused from old laboratory equipment | ||
| Rat Serum culture embryo, male rats SPRAGUE DAWLEY RjHan SD | Janvier Labs | 9979 | |
| Set of 160 mm fines | RS PRO | 541-6933 | |
| Standard 1.0 mm glass capillaries | Anima Lab | 1B100F-3 | |
| Sterile 0.22 μm syringe filter | Corning | 431218 | |
| Sterile 5 mL syringe | Fisher Scientific | 15809152 | |
| Tungsten needles | |||
| Ultrasonic homogeniser (sonicator) | Bandelin | BASO_17021 |
Riferimenti
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