T細胞白血病における癌遺伝子研究のためのデルタ様4発現間質細胞上でのマウス胸腺細胞の共培養と形質導入

記載されているすべての動物実験は、NIH機関バイオセーフティ委員会(IBC)および動物管理および使用委員会(ACUC)によって承認されました。このプロトコルで使用されるすべての試薬と材料に関連する詳細については、 材料表 を参照してください。レトロウイルス産生細胞の培養および維持手順の詳細については、公開されているガイドライン19を参照してください。プロトコルの概要については、 図 1 を参照してください。 1. OP9-DL4細胞の培養開始(1日目) バイアルを保持し、37°Cの水浴中で穏やかに振とうすることにより、OP9-DL4細胞を迅速に解凍します。 直ちに細胞を5 mLのOP9培地(MEM-α培地、10S、50 U/mLペニシリン/ストレプトマイシン、55 μM 2-メルカプトエタノール、2 mM L-グルタミン)を入れた遠沈管に移し、凍結保護剤を除去します。 室温で300 × g で5分間遠心分離します。上清を捨て、細胞を1 mLのOP9培地に再懸濁します。 5 mLのOP9培地をT25フラスコに入れ、再懸濁した細胞をこのフラスコに加えます。37°Cおよび5%CO2で培養する。 2〜3日後、1:3スプリットを使用して細胞を継代培養します(毎週月曜日、水曜日、金曜日に細胞を通過します)。注:OP9-DL4セルは、コンフルエントに達する前に分割します。OP9-DL4フラスコは、胸腺細胞との共培養のために、6〜7日目および8〜9日目に80%〜90%コンフルエントでなければなりません。したがって、OP9-DL4セルを分割しながら、その日に必要となるOP9-DL4セルの数を計画することが重要です。フラスコから培地を廃棄し、単層を1x PBSで洗浄します。PBSを廃棄し、1 mLの0.25%トリプシンを加え、37°Cで1〜5分間、または細胞がフラスコから外れるまでインキュベートします。フラスコを叩いて細胞を取り除きます。注:(オプション)細胞解離の進行状況は顕微鏡で確認できます。 5mLのOP9培地を加えてトリプシンを不活性化し、再懸濁中にフラスコの細胞で覆われた表面をすすぎ、細胞を再懸濁します。 細胞懸濁液を室温で300 × g で5分間遠心分離し、3 mLのOP9培地に再懸濁します(1:3分割の場合)。 1 mLの細胞懸濁液を、5 mLの新しいOP9培地がすでに含まれているT25フラスコに入れます。残りのセルをフリーズ/破棄します。OP9-DL4細胞を凍結するには、細胞1バイアルに対して凍結培地1 mLの比率で、細胞を90S/10%DMSOに再懸濁します。 将来の要件に応じて、-80°Cの1 mLクライオバイアルまたは液体窒素で凍結します。長期保存のために液体窒素で保管してください。 2. レトロウイルス産生細胞株の培養開始(1日目) バイアルを保持し、37°Cの水浴中で穏やかに振とうすることにより、レトロウイルス産生細胞株を迅速に解凍します。 直ちに細胞を5 mLのレトロウイルス産生細胞培地(RPC:DMEM、10S)を入れた遠沈管に移し、凍結保護剤を除去します。 室温で300 × g で5分間遠心分離します。上清を捨て、細胞を1 mLのRPC培地に再懸濁します。 5 mLのRPC培地をT25フラスコに入れ、再懸濁した細胞をこのフラスコに加えます。37°Cおよび5%CO2で培養する。 2〜3日ごとに1:5から1:8の分割で細胞を通過させます。フラスコを叩いて細胞を取り除き、積極的にピペッティングして細胞を再懸濁します。注:これらの細胞は、トリプシンを使用せずに積極的なピペッティングを行うことでフラスコ表面から除去できます。あるいは、細胞が容易に剥離し、単一細胞懸濁液に容易にピペットで入れられるようになるまでトリプシン処理(0.05%トリプシン/0.53 mM EDTA)します。 細胞懸濁液を300 × g で5分間遠心分離し、5 mLのRPC培地に再懸濁します(1:5分割の場合)。 1 mLの細胞懸濁液を、すでに5 mLの新しいRPC培地が入っているT25フラスコに入れます。残りのセルをフリーズ/破棄します。OP9-DL4細胞について説明したのと同じ方法でレトロウイルス産生細胞を凍結します(ステップ1.4.4.1–1.4.4.2)。 3. 6ウェルプレートでのレトロウイルス産生細胞の培養開始(4〜5日目) トランスフェクションの18〜24時間前に、6ウェル組織培養プレートの各ウェルに70%〜90%のコンフルエンシーでレトロウイルス産生細胞を2 mLのRPC培地に播種し、37°Cおよび5%CO2でインキュベートします。注:形質導入される胸腺細胞2〜5×105 〜1×106 胸腺細胞ごとに、レトロウイルス産生細胞の2つのウェルをトランスフェクトします。 4.レトロウイルス産生細胞をトランスフェクトして、目的の遺伝子を含むレトロウイルスを生成します(5〜6日目) トランスフェクションの1時間前に培地を新しいRPC培地と交換します。 リポフェクション混合物を調製します(6ウェルプレートの各ウェルに対して、必要に応じてスケールアップします):250 μLの還元血清培地で4 μgのDNA(ヘルパープラスミド(pCL-Eco)2 μgおよびトランスファープラスミド(pMIG)2 μg)を希釈します。穏やかに混ぜる。 10 μLのトランスフェクション試薬をステップ4.2の還元血清培地250 uLと混合します。室温で5分間インキュベートします。 5分間のインキュベーション後、希釈したDNAを希釈トランスフェクション試薬(総容量=500 μL)と結合します。穏やかに混合し、室温で20〜25分間インキュベートします。 500 μLのDNA/トランスフェクション試薬混合物を、レトロウイルス産生細胞を含むウェルに円を描くように滴下し、穏やかに加えます。プレートを前後に揺らして穏やかに混合し、プレートを37°Cのインキュベーターで16〜24時間インキュベートします。注:サブコンフルエント細胞(80%〜90%)はトランスフェクションに最も適しており、最高のウイルス力価を生成する可能性があります。レトロウイルス産生細胞はフラスコから非常に簡単に外れるため、これらの細胞を取り扱うときは突然の動きを避けてください。 5.レトロウイルス産生細胞培地の変更(6〜7日目) トランスフェクションの約16時間後に古い培地を2 mLの新しいRPC培地と交換します。細胞を37°Cで20〜24時間インキュベートし続けます。 トランスフェクション効率を蛍光顕微鏡で評価します(オプション)。注:このプロトコルでは、GFP陽性細胞が目的の細胞です( 図2を参照)。このステップは、このプロトコルで使用するために選択されたレトロウイルスベクター(レポーター遺伝子が骨格に存在するかどうか)に依存する。 6.胸腺細胞の調製とCD4 +およびCD8 +細胞の枯渇(6〜7日目) 4〜6週齢のC57BL / 6マウスから胸腺を採取します。胸腺の収穫の詳細については、XingとHogquist20を参照してください。注:マウスは、CO2 吸入とそれに続く頸部脱臼によって安楽死させた。 胸腺をペトリ皿中の5mLのPBSに入れることにより、胸腺細胞単一細胞懸濁液を調製する。滅菌ガラススライドを使用して、スライドのつや消し表面の間に胸腺を置き、スライドを静かにこすり合わせて、2つのスライドの間で胸腺を転がします。スライドガラスをすすぎ、細胞を収集し、残りの胸腺間質組織を廃棄します。注:1つの胸腺からの推定収量は90 × 106–100 ×10 6 細胞であり、CD4およびCD8の枯渇後も細胞の約1%が残ります。生後最初の数週間のマウス胸腺の細胞性は急速に増加し、4〜6週齢でプラトーに達し、その後徐々に退縮するため、若いマウスの胸腺組織を使用して細胞の収量を向上させます21。自動血球カウンターまたは任意の代替方法を使用して細胞をカウントします。 胸腺懸濁液5 mLを細胞ストレーナーに通してピペッティングすることにより、胸腺懸濁液を30 μmまたは40 μmのフィルターでろ過します。細胞を300 × g で10分間遠心分離します。 上清を除去し、チューブあたり1 mLのバッファーを(サンプルサイズに応じて)1分間添加して、ACK溶解バッファーで赤血球を溶解します。5 mLの細胞枯渇バッファー(500 mLのPBS [pH 7.2]、0.5% BSA、2 mM 0.5M EDTA、pH 8.0)を加えてACK溶解バッファーを不活性化し、300 × g で10分間遠心分離し、カウントのために1〜5 mLの細胞枯渇バッファーに再懸濁します。注:枯渇前(枯渇前)に氷上で以下を取っておきます:カウントする70 μLの細胞懸濁液(選択したカウント細胞方法によって異なります)およびCD4およびCD8の染色およびフローサイトメトリーによる分析による枯渇の効率を決定するための200 μLの細胞懸濁液22,23。 細胞をカウントし、300 × g で10分間遠心分離します。細胞を1×107/80 μLの細胞枯渇バッファーで再懸濁します。CD4およびCD8マイクロビーズを1細胞あたり10μL×107 細胞ずつ添加します。よく混ぜ合わせ、冷蔵庫(2〜8°C)の暗所で15分間インキュベートします。 2 mLのデプレッションバッファーですすぎ、フロースルーを廃棄して、デプレッションカラムを準備します。 ステップ6.6の細胞を1×107 細胞あたり1〜2 mLの枯渇バッファーを加えて洗浄し、300 × g で10分間遠心分離します。上清を取り除いて廃棄する。 最大 1.25 × 108 細胞 を 500 μL の空乏バッファーに再懸濁します。細胞懸濁液をカラムに塗布し、フロースルー(標識されていない細胞)を回収します。カラムを1 mLのバッファーで2回洗浄し、フロースルーを回収します。注: カラムリザーバーが空の場合にのみ、新しいバッファーを追加してください。枯渇後の氷上で以下を取っておきます(枯渇後のコントロール):カウントする70 μLの細胞懸濁液(選択したカウント細胞方法に応じてこれが異なります)およびCD4およびCD8の染色およびフローサイトメトリーによる分析により枯渇の効率を決定するための1,000 μLの細胞懸濁液22,23。 枯渇前に採取した200 μLの細胞を、非染色、CD4単一染色、CD8単一染色、CD4/CD8二重染色の4つのFACSチューブに分割して、枯渇効率コントロールを染色します(フローサイトメトリーパラメーターを設定するには、非染色サンプルと単一染色サンプルを使用します)。枯渇後に採取した1,000 μLの細胞を使用してCD4およびCD8を染色し、枯渇前に採取した二重染色サンプルと比較します( 図3の典型的な枯渇結果を参照)。注:抗体メーカーの推奨に従って、フローサイトメトリー染色の容量を調整します(例:50 μLのバッファーに1 x 106 細胞あたり1 μLの抗CD4-FITC+ 0.5 μLの抗CD8-PE)。 7. OP9-DL4細胞での胸腺細胞の培養(6〜7日目) サイトカイン(10 ng/mL組換えIL-7および組換えhFLT-3)を含むOP9培地中の80%〜90%コンフルエントなOP9-DL4細胞のT25フラスコに、2〜5×105 〜×106 個の枯渇後胸腺細胞を入れます。37°Cおよび5%CO2で培養する。OP9-DL4細胞上で約24時間増殖します。注:この期間は、T細胞を形質導入可能にするために必要です( 図4の典型的な結果を参照)。胸腺細胞とOP9-DL4細胞の共培養用のT25フラスコを1つ予約し、コントロールとして使用する(形質導入されていない)。形質導入されていない胸腺細胞を陰性対照として形質導入胸腺細胞とともに染色し(ステップ9.1)、形質導入効率を評価する。形質導入されていない胸腺細胞は、細胞分化に対する導入遺伝子発現の影響を測定するためにも使用することができる。サイトカイン含有培地は1ヶ月後に廃棄してください。 8.上清からレトロウイルスを採取し、それを使用して胸腺細胞を形質導入する(8〜9日目) 6ウェルプレートを傾け、プランジャーを引っ張って上清を吸引しながらプレートの下部に3〜5 mLシリンジを配置して、トランスフェクトされた細胞からレトロウイルスを含む上清を収集します。培地を2 mLの新しいRPC培地と交換します。細胞を37°Cで20〜24時間インキュベートし続け、ステップ8.9の2回目の形質導入を行います。 レトロウイルス上清を0.45 μmシリンジフィルターでろ過し、ろ液を50 mLチューブに回収します。注:レトロウイルス上清を凍結しないでください。形質導入のために作りたてのウイルス製剤を使用してください。 積極的なピペッティングによりOP9-DL4培養物から胸腺細胞を収集し、フラスコ表面から胸腺細胞およびOP9-DL4細胞を除去した。細胞懸濁液を40 μmセルストレーナーでろ過してOP9-DL4細胞の大部分を除去し、ろ液を50 mLチューブに回収します。注:OP9細胞は非常に接着性があります。積極的なピペッティングはフラスコからOP9-DL4細胞の一部を除去する可能性がありますが、このプロセス中のOP9-DL4単層の破壊は最小限であり、OP9-DL4細胞は初代胸腺細胞よりもはるかに大きいため、外れたOP9-DL4細胞は40μm細胞ストレーナーでろ過されます。OP9-DL4細胞がまだ80%〜90%コンフルエントである場合は、胸腺細胞を除去し、同じOP9-DL4フラスコに再プレートします。あるいは、新しいOP9-DL4フラスコを準備する必要があります。 ステップ8.3の濾液中の胸腺細胞を300 × g で5分間遠心分離します。上澄み液を捨てる。 50 mLチューブで、胸腺細胞を0.5〜1 mLのOP9培地+サイトカインに再懸濁します(ステップ7.1を参照)。ウイルスを含むRPC培地を1〜2 mL追加します(胸腺細胞培地の2倍のRPC培地)。臭化ヘキサメトリン(10 μg/μLストック濃度)を加えて、8 μgの臭化ヘキサメトリン/mLの全細胞懸濁液を生成します。 細胞を850 × g で室温で1時間遠心分離してスピン植します。 フラスコあたり6 mLのOP9培地+サイトカインに細胞を再懸濁し(ステップ7.1を参照)、懸濁液をOP9-DL4細胞単層に戻します。注:または、形質導入された胸腺細胞を受け取る準備ができている新しいOP9-DL4フラスコを用意します。胸腺細胞を使用済みのOP9-DL4フラスコに戻す場合は、胸腺細胞の脊髄分泌の1時間中にOP9-DL4細胞に新しいOP9培地を追加して、細胞を健康に保ち、80%〜90%のコンフルエントを確保してください。 37°Cで一晩インキュベートします。 レトロウイルス含有細胞上清の新しいウェルを使用して、手順8.2〜8.7を繰り返します。 9. 形質導入した胸腺細胞をOP9-DL4培養で2〜5日間維持するか、必要に応じて凍結します(9日目+) CD4、CD8、CD25、CD44などのT細胞発生マーカーについて胸腺細胞を染色することにより、フローサイトメトリーによって胸腺細胞の分化を評価します23。 図5の典型的な胸腺細胞分化結果を参照されたい。