Polysomenreinigung aus Sojabohnen-Symbiose-Knötchen

Leguminosen wie Sojabohnen (Glycine max) können eine Symbiose mit bestimmten Bodenbakterien namens Rhizobien eingehen. Diese mutualistische Beziehung führt zur Bildung neuer Organe, der symbiotischen Knötchen, an den Pflanzenwurzeln. Die Knötchen sind die Pflanzenorgane, die die Bakterien beherbergen, und bestehen aus Wirtszellen, deren Zytoplasma mit einer spezialisierten Form von Rhizobien besiedelt ist, die Bakterioide genannt wird. Diese Bakterien katalysieren die Reduktion von Luftstickstoff (_N2) zu Ammoniak, das im Gegenzug für Kohlenhydrate ^1,2 auf die Pflanze übertragen wird.

Obwohl diese stickstofffixierende Symbiose eine der am besten untersuchten Pflanzen-Mikroben-Symbiosen ist, müssen noch viele Aspekte besser verstanden werden, wie zum Beispiel, wie Pflanzen, die verschiedenen abiotischen Stressbedingungen ausgesetzt sind, ihre Interaktion mit ihrem symbiotischen Partner modulieren und wie sich dies auf den Knötchenstoffwechsel auswirkt. Diese Prozesse könnten besser verstanden werden, indem das Knötchentranslatom (d.h. die Untergruppe der Boten-RNAs [mRNAs] aktiv translatiert) analysiert wird. Polyribosomen oder Polysomen sind Komplexe mehrerer Ribosomen, die mit mRNA assoziiert sind und häufig zur Untersuchung der Translation^{verwendet werden 3}. Die Polysomen-Profiling-Methode besteht aus der Analyse der mRNAs, die mit Polysomen assoziiert sind, und wurde erfolgreich eingesetzt, um die posttranskriptionellen Mechanismen zu untersuchen, die die Genexpression steuern, die in verschiedenen biologischen Prozessen auftritt ^4,5.

In der Vergangenheit konzentrierte sich die Genomexpressionsanalyse hauptsächlich auf die Bestimmung der mRNA-Häufigkeit 6,7,8,9. Es besteht jedoch ein Mangel an Korrelation zwischen Transkript- und Proteinspiegeln aufgrund der verschiedenen Stadien der posttranskriptionellen Regulation der Genexpression, insbesondere der Translation^10,11,12. Darüber hinaus wurde keine Abhängigkeit zwischen den Veränderungen auf der Ebene des Transkriptoms und denen, die auf der Ebene des Translatoms¹³ auftreten, beobachtet. Die direkte Analyse des Satzes von mRNAs, die übersetzt werden, ermöglicht eine genauere und vollständigere Messung der Zellgenexpression (deren Endpunkt die Proteinhäufigkeit ist) als die, die erhalten wird, wenn nur mRNA-Spiegel analysiert werden^14,15,16.

Dieses Protokoll beschreibt, wie pflanzliche Polysomen aus intakten Sojaknollen durch differentielle Zentrifugation durch ein zweischichtiges Saccharosekissen gereinigt werden (Abbildung 1). Da jedoch auch Bacteroid-abgeleitete Ribosomen in den Knötchen vorhanden sind, wird eine Mischung aus Ribosomen und RNA-Spezies gereinigt, obwohl die eukaryotischen die Hauptfraktion darstellen (90%-95%). Die anschließende RNA-Isolierung, Quantifizierung und Qualitätskontrolle wird ebenfalls beschrieben (Abbildung 1). Dieses Protokoll soll in Kombination mit RNA-seq experimentelle Ergebnisse zur translationalen Regulation eukaryotischer mRNAs in einem komplexen Gewebe wie dem symbiotischen Knötchen liefern.

Abbildung 1: Schematische Übersicht über die vorgeschlagene Methodik zur eukaryotischen Polysomenreinigung aus symbiotischen Knötchen. Das Schema gibt einen Überblick über die Schritte, die im Protokoll von (1) Pflanzenwachstum und (2) Knötchenernte bis (3) Herstellung der zytosolischen Extrakte, (3) Gewinnung von GESAMTPROBEN und (4) PAR-Proben und (5) RNA-Extraktion und Qualitätskontrolle befolgt werden. Abkürzungen: PEB = Polysomenextraktionspuffer; RB = Resuspensionspuffer; TOTAL = Gesamt-RNA; PAR = Polysom-assoziierte mRNA. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.