聚合物拥挤脂质膜上的单分子扩散和组装

细胞膜是高度拥挤和复杂的系统¹。分子拥挤会对蛋白质和脂质2，^3，4等膜结合实体的扩散产生相当大的影响。同样，脂质膜上的双分子反应如受体二聚化或膜复合物的寡聚化也受到拥挤^5，6，7的影响。拥挤器的性质、构型和浓度可以通过多种方式控制膜结合、扩散率和蛋白质-蛋白质相互作用^8，9。由于控制细胞膜上的膜拥挤并解释其对嵌入生物分子的影响具有挑战性，因此研究人员试图建立替代体外系统¹⁰。

人工拥挤膜的一种流行方法是用聚合物（如聚乙二醇，PEG）接枝脂质^11，12掺杂双层膜。在支撑脂质双层（SLB）上蛋白质和脂质动力学的可视化过程中，这些聚合物通过有效地将双层从底层载体上抬起，另外将膜包埋的组分与底层带负电的基底（如玻璃）隔离开来。通过改变聚合物的大小和浓度，可以控制分子拥挤的程度，以及它与底层固体载体的分离^13，14。这显然比在没有聚合物垫¹⁵，16的固体底物上支撑的脂质双层更具优势，其中跨膜生物分子可以失去其活性¹⁷，^18，19。更重要的是，它使我们能够在体外概括细胞膜的拥挤环境，这对于许多膜过程至关重要。

膜上的表面接枝聚合物也会根据其接枝密度¹²而改变其构型。在低浓度下，它们保持在膜表面上方的熵卷曲结构中，称为蘑菇。随着浓度的增加，它们开始相互作用并趋向于展开和延伸，最终在膜上产生密集的刷状形成²¹。由于从蘑菇到刷状状态的过渡是高度异质的，并且表现为聚合物的表征条件不佳，因此在聚合物接枝膜上使用表征良好的拥挤条件非常重要。与最近的一项研究²⁰相比，我们确定并报告了维持跨膜生物分子扩散运输和活性的拥挤膜组成。

在该协议中，我们讨论了如何生成聚乙二醇化脂质膜，并为模拟两种不同聚合物配置（即蘑菇和刷子）中的拥挤的PEG密度提供了建议。该协议还描述了嵌入这些拥挤膜中的分子的单分子结合，颗粒跟踪和光漂白数据采集和分析。首先，我们描述了彻底的清洁步骤，成像室的组装以及PEG-SLB的生成。其次，我们提供了单分子结合，粒子跟踪和光漂白实验的详细信息。第三，我们讨论i）提取相对结合亲和力，ii）表征分子扩散，以及iii）从膜上的单分子电影中计数蛋白质组装中的亚基。

虽然我们用单分子成像表征了该系统，但该协议对于所有有兴趣了解拥挤对脂质膜生物分子反应的影响的膜生物物理学家都是有用的。总体而言，我们提出了一个强大的管道，用于制造拥挤和支持的脂质双层，以及对其进行的各种单分子测定和相应的分析程序。