Beurteilung der intestinalen Transzytose von neonatalen Escherichia coli Bacteremia-Isolaten

Escherichia coli ist die häufigste Ursache für eine früh einsetzende Sepsis bei Neugeborenen ^1,2,3. Die Sterblichkeitsrate der neonatalen E. coli-Bakteriämie kann 40% erreichen, und Meningitis ist eine mögliche Komplikation, die mit schweren neurologischen Entwicklungsstörungen einhergeht². Die Aufnahme von mütterlichen E. coli-Stämmen durch das Neugeborene kann zu neonataler Bakteriämie führen; Dieser Prozess wurde in Tiermodellen^{repliziert 2,4}. Einmal eingenommen, wandern pathogene Bakterien aus dem neonatalen Darmlumen über die Darmbarriere und gelangen in den Blutkreislauf, was zu einer Sepsis führt. Neonatale invasive E. coli-Stämme, die Bakteriämien produzieren, unterscheiden sich in ihrer Fähigkeit, in Darmepithelzellen einzudringen ^1,5. Ihre Fähigkeit, das Darmepithel nach der Invasion zu transzytieren, ist jedoch nicht vollständig charakterisiert.

Dieses intestinale Transzytosemodell ist eine nützliche In-vitro-Methode, um die bakterielle Passage durch das Darmepithel zu emulieren. Das übergeordnete Ziel der in diesem Manuskript vorgestellten Methoden ist es, die Fähigkeit von neonatalen E. coli-Isolaten zu vergleichen, das Darmepithel zu transzytieren. Das hier beschriebene Modell verwendet T84-Zellen, die immortalisierte humane intestinale Adenokarzinomzellen ^6,7 sind. T84-Zellen werden auf einer semipermeablen Membran mit zwei getrennten Kompartimenten zum Zusammenfluss gezüchtet. Der Grund für die Anwendung dieser Technik ist, dass diese Darmzellen, wie in vivo geschehen, polarisieren und reife Tight Junctions entwickeln ^6,8. Die Seite, die mit der Membran in Kontakt kommt, wird zur basalen Seite. Die gegenüberliegende Seite der Zellen wird zur apikalen Seite und ähnelt dem Darmlumen, wo aufgenommene Krankheitserreger haften und eindringen. Die Transwell-Membran ist durchlässig für Bakterien, aber die polarisierten Darmzellen bilden enge Verbindungen, die die bakterielle parazelluläre Bewegung beeinträchtigen⁹. Somit bietet diese Methode den Vorteil einer kontrollierten In-vitro-Umgebung, in der eine menschliche Zelllinie verwendet wird, um den Prozess der bakteriellen Transzytose, einschließlich des transzellulären Weges, zu untersuchen. Während es andere Methoden gibt, um die Transzytose von Bakterien über das Darmepithel zu untersuchen, bietet die hier vorgestellte Transwell-Methode eine größere Leichtigkeit und Zugänglichkeit. Es stehen alternative Techniken zur Verfügung, z. B. unter Verwendung von Ex-vivo-Proben, die in Ussing-Kammersystemen eingerichtet wurden. Sie verwenden jedoch Gewebeproben, die möglicherweise nicht leicht zugänglich sind, insbesondere wenn die Forschung beabsichtigt, die menschliche Physiologie zu untersuchen¹⁰. Intestinale Organoide stellen ein weiteres Beispiel für eine In-vitro-Alternative zur Untersuchung von Wirt-Bakterien-Interaktionen dar¹¹. Während organoide Monoschichten auch im Transwell-System verwendet werden können, um bakterielle Transzytose zu untersuchen, erfordern sie die Isolierung und das Wachstum von Stammzellen und die Verwendung spezifischer Wachstumsfaktoren, um die Differenzierung zu induzieren¹². Daher ist ihre Verwendung zeitaufwendiger und mit höheren Kosten verbunden als die in diesem Manuskript beschriebene Transwell-Methode.

Die Beurteilung der bakteriellen Passage durch das Darmepithel mit diesem In-vitro-Transwell-System wurde erfolgreich für verschiedene Krankheitserreger durchgeführt. Diese Studien haben den Nutzen des Transwell-Systems unter Verwendung von T84-Zellen gezeigt, um die Transzytose von Bakterien über das polarisierte Darmepithel zu charakterisieren^13,14,15. Die Anwendung dieser Transwell-Methode zum Vergleich der Transzytosefähigkeit von Bakteriämie erzeugenden neonatalen E. coli-Stämmen wurde jedoch nicht detailliert beschrieben. Dieses Manuskript bietet anderen Forschern ein Standard-Transwell-Protokoll, das zuverlässig und einfach zu bedienen ist und keine zu teuren Ressourcen erfordert.

Um die Fähigkeit neonataler invasiver E. coli-Stämme zur Transzytose des Darmepithels zu vergleichen, kann die apikale Seite der intestinalen Epithelmonoschicht mit einer bekannten Anzahl von Bakterienzellen infiziert werden. Nach der Inkubation kann das Medium auf der basalen Seite des Epithels gesammelt und die Bakterien quantifiziert werden, um die Menge der bakteriellen Transzytose im Laufe der Zeit zu bestimmen. In diesem Manuskript werden die vorgestellten Methoden verwendet, um die Transzytosefähigkeit von klinischen E. coli-Stämmen von Neugeborenen zu untersuchen, die von Neugeborenen mit Bakteriämie hospitalisiert wurden. Die Einschlusskriterien für die Auswahl dieser neonatalen klinischen Isolate für Transzytosestudien wurden bereits veröffentlicht ^1,2,16. Wenn diese Methode mit verschiedenen E. coli-Stämmen durchgeführt wird, können ihre Transzytosefähigkeiten verglichen werden. Durch diesen Prozess liefert das intestinale Transzytosemodell wertvolle Daten zur Charakterisierung der Virulenzfaktoren von E. coli, die zu dem mehrstufigen Prozess beitragen, der in der Entwicklung einer neonatalen Bakteriämie gipfelt.