Evaluación de la transcitosis intestinal de aislados de bacteriemia neonatal por Escherichia coli

Escherichia coli es la causa más común de sepsis de inicio temprano en recién nacidos ^1,2,3. La tasa de mortalidad de la bacteriemia neonatal por E. coli puede alcanzar el 40%, y la meningitis es una posible complicación asociada a discapacidades graves del desarrollo neurológico². La ingestión de cepas maternas de E. coli por el recién nacido puede producir bacteriemia neonatal; Este proceso ha sido replicado en modelos animales ^2,4. Una vez ingeridas, las bacterias patógenas viajan desde la luz intestinal neonatal a través de la barrera intestinal y entran en el torrente sanguíneo, causando septicemia. Las cepas neonatales invasivas de E. coli que producen bacteriemia varían en su capacidad para invadir las células epiteliales^{intestinales 1,5}. Sin embargo, su capacidad para transcitar el epitelio intestinal después de la invasión no ha sido completamente caracterizada.

Este modelo de transcitosis intestinal es un método in vitro útil para emular el paso bacteriano a través del epitelio intestinal. El objetivo general de los métodos presentados en este manuscrito es comparar la capacidad de los aislados neonatales de E. coli para transcitar el epitelio intestinal. El modelo descrito aquí utiliza células T84, que son células de adenocarcinoma intestinal humano inmortalizadas ^6,7. Las células T84 se cultivan para confluir en una membrana semipermeable con dos compartimentos separados. La justificación para utilizar esta técnica es que, como sucede in vivo, estas células intestinales se polarizan y desarrollan uniones estrechas maduras ^6,8. El lado en contacto con la membrana se convierte en el lado basal. El lado opuesto de las células se convierte en el lado apical, parecido a la luz intestinal donde los patógenos ingeridos se adhieren e invaden. La membrana transwell es permeable a las bacterias, pero las células intestinales polarizadas forman uniones estrechas, que perjudican el movimiento paracelular bacteriano⁹. Por lo tanto, este método proporciona la ventaja de un entorno in vitro controlado que utiliza una línea celular humana para estudiar el proceso de transcitosis bacteriana, incluida la ruta transcelular. Mientras que existen otros métodos para investigar la transcitosis de bacterias a través del epitelio intestinal, el método transwell presentado aquí proporciona una mayor facilidad y accesibilidad. Se dispone de técnicas alternativas, como las que utilizan muestras ex vivo instaladas en sistemas de cámaras Ussing. Sin embargo, utilizan muestras de tejido que pueden no ser fácilmente accesibles, particularmente si la investigación tiene la intención de estudiar la fisiología humana¹⁰. Los organoides intestinales representan otro ejemplo de una alternativa in vitro para estudiar las interacciones huésped-bacteria¹¹. Mientras que las monocapas organoides también pueden ser utilizadas en el sistema transwell para estudiar la transcitosis bacteriana, requieren el aislamiento y crecimiento de células madre y el uso de factores de crecimiento específicos para inducir la diferenciación¹². Por lo tanto, su uso requiere más tiempo y se asocia con mayores costos en comparación con el método transwell descrito en este manuscrito.

La evaluación del paso bacteriano a través del epitelio intestinal utilizando este sistema de transwell in vitro se ha realizado con éxito para varios patógenos. Estos estudios han demostrado la utilidad del sistema transwell utilizando células T84 para caracterizar la transcitosis de bacterias a través del epitelio intestinal polarizado^13,14,15. Sin embargo, la aplicación de este método transwell para comparar la capacidad de transcitosis de cepas neonatales de E. coli productoras de bacteriemia no se ha descrito en detalle. Este manuscrito proporciona a otros investigadores un protocolo estándar de transwell que es confiable y fácil de usar y no requiere recursos demasiado caros.

Para comparar la capacidad de las cepas neonatales invasivas de E. coli para transcitar el epitelio intestinal, el lado apical de la monocapa epitelial intestinal puede infectarse con un número conocido de células bacterianas. Después de la incubación, se puede recolectar el medio en el lado basal del epitelio y cuantificar las bacterias para determinar la cantidad de transcitosis bacteriana a lo largo del tiempo. En este manuscrito, los métodos presentados se utilizan para estudiar la capacidad de transcitosis de cepas clínicas neonatales de E. coli recuperadas de recién nacidos hospitalizados con bacteriemia. Los criterios de inclusión para la selección de estos aislados clínicos neonatales para estudios de transcitosis han sido publicados previamente ^1,2,16. Cuando este método se realiza utilizando diferentes cepas de E. coli, se pueden comparar sus capacidades de transcitosis. A través de este proceso, el modelo de transcitosis intestinal proporciona datos valiosos para caracterizar los factores de virulencia de E. coli que contribuyen al proceso de múltiples pasos que culmina en el desarrollo de bacteriemia neonatal.